过表达CD63基因的间充质干细胞及其制备方法、应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及过表达CD63基因的间充质干细胞及其制备方法、应用。本发明专利技术构建过表达CD63基因的慢病毒载体后，将其转染间充质干细胞，最终获得了稳定表达CD63的CD63

【技术实现步骤摘要】
过表达CD63基因的间充质干细胞及其制备方法、应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及过表达CD63基因的间充质干细胞及其制备方法、应用。

技术介绍

[0002]外泌体(Exosome，Exo)：一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径大约30
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150nm，具有脂质双层膜结构，携带RNA和蛋白质，被大多数细胞类型释放，是细胞间通讯系统的一部分。几乎所有的细胞都分泌胞外囊泡，包括间充质干细胞，间充质干细胞来源的胞外囊泡含有与母细胞相似的成分，如细胞因子、生长因子、脂类、mRNAs及调控型miRNAs等。他们主要参与细胞与细胞间的交流通讯及改变组织的微环境等，在免疫调控，组织损伤修复等方面起着不可低估的作用。
[0003]间充质干细胞作为一种成体多能干细胞，具有多种组织来源，能够分化为多种细胞系并有强大的旁分泌因子效应。间充质干细胞具有免疫原性低，组织修复再生的高的优点，研究发现，间充质干细胞的治疗作用主要通过其旁分泌作用。间充质干细胞不仅能分泌一些可溶性生物活性因子，亦可分泌胞外微囊泡，即外泌体，可促进血管再生，抑制细胞凋亡及纤维化，进而促进损伤组织修复再生。
[0004]越来越多的研究表明，干细胞外泌体可减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学作用。外泌体的这些作用使得其在治疗心肌梗死，皮肤创伤等组织损伤中存在良好的应用前景，并且已经有较多深入的研究。与干细胞的移植治疗相比，干细胞外泌体可以降低细胞移植致瘤风险，因此通过干细胞来源的外泌体进行促进血管生成和增强损伤细胞修复，有望成为组织损伤修复的治疗新策略。外泌体的独特生物学优势也为未来药物载体的研发开启了一条全新的思路。科学家们认为与干细胞相比，使用干细胞分泌的外泌体治疗的安全性更高及可操作性更强。因为干细胞外泌体作为治疗产品具有干细胞制剂不具有的某些特性，例如外泌体相比活细胞而言，成分比较确定，易于质量控制；并且外泌体在体外环境下的稳定性更有利于运输和保存。因此，这些特性使得外泌体具有很大的应用价值。
[0005]然而，外泌体技术作为递送平台的临床前和临床开发需要大量的外泌体。外泌体的分离方法需要易于扩展以支持大规模生产。与永生肿瘤细胞系不同，间充质干细胞(MSC)的扩增能力是有限的。目前，传统的提取方法获得的外泌体的产量较低并且不可扩展，阻碍了间充质干细胞用于外泌体的大规模生产，进而影响外泌体在临床前动物中的功效评估。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供过表达CD63基因的间充质干细胞及其制备方法、应用。本专利技术通过过表达CD63基因获得了稳定表达CD63的CD63
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MSC细胞株。经提取检测，该细胞株提明显提高了单位细胞与单位培养基体积的外泌体得率，外泌体的产量显著提高。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了CD63基因在促进间充质干细胞产生和/或释放外泌体中的应用。
[0009]本专利技术研究发现，通过过表达CD63基因能够促进间充质干细胞产生和/或释放外泌体。
[0010]一些实施方案中，所述CD63基因为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或SEQ ID NO:1所示的序列经缺失、取代、添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。
[0011]本专利技术还提供了过表达CD63基因的间充质干细胞。
[0012]一些实施方案中，所述CD63基因为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或SEQ ID NO:1所示的序列经缺失、取代、添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。
[0013]一些实施方案中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、羊膜间充质干细胞或牙髓间充质干细胞。
[0014]一些具体实施例中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
[0015]一些实施方案中，所述过表达CD63基因的间充质干细胞由以下方法制得：
[0016]构建过表达CD63基因的重组慢病毒，转染间充质干细胞。
[0017]具体地，本专利技术过表达CD63基因的间充质干细胞由以下方法制得：
[0018]以pLv122载体为基础载体，构建过表达CD63基因的重组质粒pLV122
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CD63，转染293T细胞系包装获得重组慢病毒，命名为LV122
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CD63，将重组慢病毒LV122
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CD63转染至间充质干细胞中，获得了稳定表达CD63的细胞株，命名为MSC
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LV122
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CD63。
[0019]本专利技术还提供了上述过表达CD63基因的间充质干细胞的制备方法，由以下方法制得：
[0020]构建过表达CD63基因的重组慢病毒，转染间充质干细胞。
[0021]在一些实施方案中，所述过表达CD63基因的间充质干细胞的制备方法，由以下方法制得：
[0022]以pLv122载体为基础载体，构建过表达CD63基因的重组质粒pLV122
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CD63，转染293T细胞系包装获得重组慢病毒，命名为LV122
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CD63；将重组慢病毒LV122
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CD63转染至间充质干细胞中，获得稳定表达CD63的细胞株，命名为MSC
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LV122
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CD63。
[0023]一些实施方案中，所述CD63基因为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或SEQ ID NO:1所示的序列经缺失、取代、添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。
[0024]一些实施方案中，所述慢病毒为Lv122。
[0025]本专利技术中，将构建的过表达CD63基因的重组慢病毒，命名为LV122
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CD63慢病毒，转染MSC后筛选获得高表达CD63的MSC细胞株。
[0026]本专利技术还提供了上述间充质干细胞上述制备方法制得的间充质干细胞在制备促进组织损伤修复、调控免疫反应或改善缺血再灌注损伤的药物中的应用。
[0027]本专利技术以pLv122载体为基础载体，构建了过表达CD63基因的重组质粒pLV122
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CD63，转染293T细胞系包装获得重组慢病毒，命名为LV122
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CD63，将重组慢病毒LV122
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CD63转染至间充质干细胞中，获得了稳定表达CD63的细胞株，命名为MSC
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LV122
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CD63。经检测，该细胞株明显提高了单位细胞与单位培养基体积的外泌体得率，外泌体的产量得到显著提高。
[0028]本专利技术还提供了促进间充质干细胞产生和/或释放外泌体的方法，取上述过表达CD63基因的间充质干细胞培养，提取外泌体。
[0029]一些实施方案中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
[0030]一些实施方案中，所述培养采本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CD63基因在促进间充质干细胞产生和/或释放外泌体中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CD63基因为SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列，或SEQ ID NO:1所示的序列经缺失、取代、添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。3.过表达CD63基因的间充质干细胞，其特征在于，所述CD63基因为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或SEQ ID NO:1所示的序列经缺失、取代、添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、羊膜间充质干细胞或牙髓间充质干细胞。5.根据权利要求3所述的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞由以下方法制得：构建过表达CD63基因的重组慢病毒，转染间充质干细胞。6.权利要求3～5任一项所述的间充质干...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟敬祥，陈海佳，郝莉莉，姜交华，马诗思，尹佳杨，陈东煌，戚康艺，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司广东国科细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：