一种融合基因、基因工程菌及生产PHB的方法技术

本发明专利技术公开了一种基因工程菌及生产PHB的方法。本发明专利技术还公开了一种融合基因，其包含编码Ncgl1289信号肽的核苷酸与phaC基因，所述编码Ncgl1289信号肽的核苷酸与phaC基因的序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:4所示。所述基因工程菌为谷氨酸棒状杆菌工程菌，其包含融合基因并分泌表达PHA合酶，能够高效的生产PHB，并能提高利用木质纤维素来源的底物生产聚

【技术实现步骤摘要】
一种融合基因、基因工程菌及生产PHB的方法


[0001]本专利技术属于合成生物学领域，涉及一种分泌表达PHA合酶的谷氨酸棒状杆菌基因工程菌、利用其生产聚
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羟基丁酸脂的方法、该基因工程菌的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]聚羟基烷酸酯(PHAs)是一类由微生物全合成的高分子聚酯，这种聚合材料具有与石油基聚丙烯材料相当的热化学性能和物理强度，并且具有很好的生物相容性和生物可降解性，因此具有潜力替代传统的石油基塑料，减轻传统石油基塑料给环境带来的“白色污染”问题。PHA根据组成单体类别和聚合度的不同会有不同的材料性质，其中最简单的PHA是由单一的3
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羟基丁酰辅酶A为单体聚合而成的聚3
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羟基丁酸酯，简称PHB。
[0003]目前微生物发酵生产PHB的技术，均以粮食淀粉作为可发酵单糖的原料来源，其成本占到PHB总成本的一半左右。粮食淀粉生产PHB不仅大幅度提高了生产成本，而且存在“与人争粮”的问题，无法实现PHB对石油基聚合物的替代。非粮可发酵单糖的非粮碳水化合物糖原料中，玉米秸秆、小麦秸秆、稻草、蔗渣、林业废弃物等木质纤维素生物质具有价格低廉、来源广泛的特征，以先进生物炼制的方式获得葡萄糖、木糖等可发酵单糖，进而以其作为糖原料发酵生产PHB，不仅具有原料来源充分、成本低廉的优势，而且在减少环境污染、碳中和技术、促进农业产业升级等各个方面具有巨大的潜力。
[0004]PHB的合成过程主要由三个不同的基因驱动：PhaA、PhaB和PhaC。其中，phaC基因编码的PHA合酶负责PHB合成的最后一步聚合反应，被认为在PHB合成中起着关键作用。PHB作为一种胞内产物，在工业化生产过程中，需要通过大规模的破壁分离操作将胞内的PHB提取出来，这种复杂的操作成本大约占据了PHB生产总成本的30％，如果可以实现PHB的分泌生产，将可以极大的降低PHB的生产成本。

技术实现思路

[0005]为了克服上述缺点/缺陷，本专利技术的目的在于提供一种分泌表达PHA合酶提高生产聚
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羟基丁酸脂产量的谷氨酸(C.glutamicum)棒状杆菌工程菌。通过介导Sec途径的Ncgl1289信号肽(缩写为Ncgl)实现PHA合酶的分泌表达。最终本专利技术构建的工程菌株可以高效生产PHB，例如利用木质纤维素水解液高效生产PHB。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供一种融合基因，所述融合基因包含编码Ncgl1289信号肽的核苷酸与phaC基因，所述编码Ncgl1289信号肽的核苷酸与phaC基因的序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:4所示。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术第二方面提供一种表达盒，所述表达盒包括如本专利技术第一方面所述的融合基因，所述表达盒的启动子包括Peftu、Psod、PH3。优选地，所述启动子为Peftu，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术第三方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包括骨架质粒和如本专利技术第二方面所述的表达盒。优选地，所述骨架质粒选自pTRCmob
或pEC
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XK99E。
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术第四方面提供一种基因工程菌，包含如本专利技术第三方面所述的重组表达载体。
[0010]优选地，所述基因工程菌过表达PhaA基因和PhaB基因。更优选地，所述基因工程菌还过表达xylAB基因。
[0011]为了解决上述技术问题，本专利技术第五方面提供一种构建如本专利技术第四方面所述的基因工程菌的方法，所述方法包括：
[0012](1)将如本专利技术第一方面所述的融合基因插入骨架质粒中，得到重组表达载体。优选地，所述骨架质粒选自pTRCmob或pEC
‑
XK99E。
[0013](2)将重组表达载体转入出发菌株，经筛选后获得所述基因工程菌。优选地，所述出发菌株为谷氨酸棒状杆菌。更优选地，所述出发菌株为C.glutamicum JH02。
[0014]为了解决上述技术问题，本专利技术第六方面提供一种生产PHB的方法，所述方法包括：在培养基中利用五碳糖和/或六碳糖为底物对如本专利技术第四方面所述的基因工程菌进行发酵。
[0015]优选地，所述培养基包括硫酸铵、硫酸镁；和/或，所述六碳糖为葡萄糖，所述五碳糖为木糖。
[0016]在某一具体实施例中，所述发酵的条件满足以下一种或多种：所述发酵在以下条件进行：温度28～32℃，转速500～700rpm，pH 6.8～7.2；和/或，
[0017]所述葡萄糖的含量为90
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110g/L，所述木糖的含量为0～40g/L；和/或，
[0018]所述硫酸铵的含量为18
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22g/L，所述硫酸镁的含量为0.2～0.3g/L。
[0019]优选地，所述温度为30℃，所述转速为600rpm，所述pH为7.0；和/或，
[0020]所述葡萄糖的含量为92.7g/L，所述木糖的含量为39.8g/L。
[0021]更优选地，所述培养基包括30.0g/L葡萄糖，1.0g/L磷酸二氢钾，3.0g/L尿素，0.6g/L硫酸镁，5.0g/L酵母提取物和10.0g/L蛋白胨。
[0022]在某一具体实施例中，所述底物来源于天然原材料的水解液，所述天然原材料为农业废弃物或林业废弃物。优选地，所述农业废弃物包括小麦秸秆、玉米秸秆、稻草、蔗渣。
[0023]在某一具体实施例中，所述天然原材料的水解液的制备方法包括下述步骤：
[0024]将所述天然原材料经过预处理、脱毒、酶水解，固液分离去除固体，收集清液，得到天然原材料的水解液。通过脱毒处理去除对菌株发酵PHB有不利影响的毒性抑制物。可以通过能够代谢毒性抑制物的菌株对所述预处理后的天然原材料或所述的酶水解液进行脱毒处理，从而去除所述毒性抑制物。即脱毒的方式可以是生物法脱毒。
[0025]常规预处理方法包括酸预处理、碱预处理、蒸汽爆破预处理、热水预处理和离子液体预处理，但并不因此将本专利技术限制在上述的预处理方法范围之中。
[0026]优选地，所述固液分离的方式包括；离心、过滤；所述离心的转速优选为10000～15000rpm，所述离心的时长优选为8～15分钟。
[0027]更优选地，所述清液进行灭菌和过滤。
[0028]为了解决上述技术问题，本专利技术第七方面提供一种如本专利技术第一方面所述的融合基因、本专利技术第二方面所述的表达盒、本专利技术第三方面所述的重组表达载体或本专利技术第四方面所述的基因工程菌在生产PHB中的应用。
[0029]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。
[0030]本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0031]本专利技术的积极进步效果在于：
[0032]本专利技术构建的工程菌株可以高效生产PHB，并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因包含编码Ncgl1289信号肽的核苷酸与phaC基因，所述编码Ncgl1289信号肽的核苷酸与phaC基因的序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:4所示。2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括如权利要求1所述的融合基因，所述表达盒的启动子包括Peftu、Psod或PH36；优选地，所述启动子为Peftu，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括骨架质粒和如权利要求2所述的表达盒；优选地，所述骨架质粒选自pTRCmob或pEC
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XK99E。4.一种基因工程菌，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体；优选地，所述基因工程菌过表达PhaA基因和PhaB基因；更优选地，所述基因工程菌还过表达xylAB基因。5.一种构建如权利要求4所述的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)将如权利要求1所述的融合基因插入骨架质粒中，得到重组表达载体；优选地，所述骨架质粒选自pTRCmob或pEC
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XK99E；(2)将重组表达载体转入出发菌株，经筛选后获得所述基因工程菌；优选地，所述出发菌株为谷氨酸棒状杆菌；更优选地，所述出发菌株为C.glutamicum JH02。6.一种生产PHB的方法，其特征在于，所述方法包括：在培养基中利用五碳糖和/或六碳糖为底物对如权利要求4所述的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：金慈，李静，黄振，鲍杰，张明明，刘修才，
申请(专利权)人：CIBT美国公司，
类型：发明
国别省市：