提高α-变形菌门甲基营养菌在植物叶际生长定殖的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高α

【技术实现步骤摘要】
提高
α
‑
变形菌门甲基营养菌在植物叶际生长定殖的方法


[0001]本专利技术涉及一种有效提高α
‑
变形菌门甲基营养菌在寡碳源条件下生长和植物叶际生长定殖的方法，属于微生物技术和现代农业领域。

技术介绍

[0002]甲基营养菌（Methylotrophs）能够利用植物叶际细胞壁果胶代谢释放的副产物甲醇作为生长的碳源和能源，是定殖在许多植物和农作物（如：拟南芥、小麦、大豆、玉米、水稻、苜蓿、烟草、西红柿、甜瓜、辣椒、白菜）叶际优势菌群。甲基营养菌（如：稻谷甲基杆菌Methylorubrum oryzae、结瘤甲基杆菌M. nodulans、扭脱甲基杆菌M. extorquens、耐辐射甲基杆菌M. radiotolerans、絮凝甲基杆菌M. gregans和西班牙甲基杆菌M. hispanicum）能释放植物生长素与分裂素促植物生长，能释放胞外酶和铁载体蛋白转化植酸成为可溶性磷和促进铁吸收或具有生物固氮的能力，能合成抑制病原微生物生长的次生代谢物质起到生物防治作用。因此，甲基营养菌具有显著提高农作物在自然环境和干旱、盐碱、病害等逆境下生长和生产能力，降低了对有机化肥和化学农药依赖度，促进农作物稳产高产，是一类极具开发应用前景的植物益生菌剂。但是植物叶际环境复杂，尤其是相比于植物根际，叶际面临营养元素稀缺的逆境。研究报道农作物叶片释放甲醇量随作物种类、周围环境因素等波动显著，每克干重叶片每小时释放甲醇量从0.5
ꢀµ
g到35.0
ꢀµ
g不等，释放速率小于1.0
ꢀµ
mmol g
‑
1 h
‑1，而且其他类碳源浓度也是微量。
[0003]因而，研究如何加强甲基营养菌在寡营养叶际环境生长能力，能显著促进甲基营养菌的叶际定殖效果，提高农作物的生长和生产。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供提高α
‑
变形菌门甲基营养菌在植物叶际生长定殖的方法，以弥补现有技术的不足。
[0005]磷酸核糖焦磷酸激酶（Ribose
‑
phosphate diphosphokinase），是嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸、组氨酸、色氨酸以及还原力从头合成的第一个限速酶，催化核糖
‑5‑
磷酸（Ribose
‑5‑
phosphate）磷酸化生成磷酸核糖焦磷酸（Phosphoribosyl pyrophosphate）。嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸等的从头合成过程消耗大量ATP和前体代谢物。磷酸酮醇酶途径（Phosphoketolase pathway）能够利用磷酸酮醇酶（Phosphoketolase）催化果糖
‑6‑
磷酸（Fructose
‑6‑
phosphate）裂解成赤藓糖
‑4‑
磷酸（Erythrose
‑4‑
phosphate）和乙酰磷酸（Acetyl
‑
phosphate）或者催化木酮糖
‑5‑
磷酸（Xylulose
‑5‑
phosphate）裂解成甘油醛
‑3‑
磷酸（Glyceraldehyde
‑3‑
phosphate）和乙酰磷酸。乙酰磷酸随后转化成重要的中心代谢物乙酰辅酶A。磷酸酮醇酶途径合成乙酰辅酶A的过程中不产生二氧化碳，是碳中和。α
‑
变形菌门甲基营养菌（例如模式菌扭脱甲基杆菌M. extorquens）利用丝氨酸循环（Serine cycle）耦合乙基丙二酰辅酶A途径（Ethylmalonyl
‑
CoA pathway）同化甲醇和二氧化碳，即同化2分子甲醇和4分子二氧化碳合成1分子乙酰辅酶A和2分子乙醛酸，但是阻断磷酸酮醇酶途径不
影响细胞正常生长，表明该途径在标准实验室培养条件下（即：甲醇浓度120 mM）是一条非必需的代谢途径。前期报道还表明α
‑
变形菌门甲基营养菌在植物叶际定殖时，除了以甲醇作为主要碳源，还能利用其他多碳物质（如：草酸、丙酮酸、琥珀酸）作为碳源。
[0006]为了有效提高α
‑
变形菌门甲基营养菌在植物叶际定殖和生长，需要一种技术策略通过优化中心代谢的代谢通量分配，使得寡碳源下细胞代谢更加平衡而高效，从而提高植物叶片上生长和定殖能力。本专利技术经研究发现在α
‑
变形菌门甲基营养菌中下调磷酸核糖焦磷酸激酶功能，或通过提高磷酸酮醇酶途径的代谢通量，能够显著增强α
‑
变形菌门甲基营养菌在寡碳源上生长能力，而且在植物叶际定殖效果明显优于野生菌。
[0007]结合上述研究，为达到上述目的，本专利技术采取的具体技术方案为：一种α
‑
变形菌门甲基营养菌的突变株，该突变株以α
‑
变形菌门甲基营养菌为基础，通过蛋白质氨基酸序列突变技术、核苷酸序列突变技术或其他突变技术，使该α
‑
变形菌门甲基营养菌的磷酸核糖焦磷酸激酶发生突变，以降低磷酸核糖焦磷酸激酶催化活性。
[0008]一种α
‑
变形菌门甲基营养菌的改造菌株，该改造菌株以α
‑
变形菌门甲基营养菌为基础，通过现代分子生物学技术降低其磷酸核糖焦磷酸激酶基因的转录水平或翻译水平；所述现代分子生物学技术包括但不限于CRISPRi技术，RNAi技术，基因启动子或核糖体结合位点序列替换技术等。
[0009]一种α
‑
变形菌门甲基营养菌的工程菌，该工程菌以α
‑
变形菌门甲基营养菌为基础，通过质粒基因过表达技术，或通过增加α
‑
变形菌门甲基营养菌的基因组上目标基因拷贝数，或通过基因组上基因元件替换改造技术，或采用其他分子生物学技术，提高α
‑
变形菌门甲基营养菌的磷酸酮醇酶代谢途径相关基因的表达水平即可，以增加磷酸酮醇酶代谢途径的代谢通量。
[0010]进一步的，所述α
‑
变形菌门甲基营养菌是指以有机碳一，包括甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、甲胺作为生长的碳源和能源，利用丝氨酸循环途径耦联乙基丙二酰辅酶A途径及三羧酸循环同化有机碳一的一类菌落呈粉色的革兰氏阴性细菌，包括但不限于稻谷甲基杆菌M. oryzae、结瘤甲基杆菌M. nodulans、扭脱甲基杆菌M. extorquens、耐辐射甲基杆菌M. radiotolerans、絮凝甲基杆菌M. gregans和西班牙甲基杆菌M. hispanicum。
[0011]进一步的，所述磷酸酮醇酶代谢途径相关基因为磷酸酮醇酶（xfp），磷酸转乙酰酶(pta)，乙酸激酶(ack)，乙酰辅酶A合成酶(acs)等。
[0012]所述α
‑
变形菌门甲基营养菌的突变株或所述α
‑
变形菌门甲基营养菌的改造菌株或α
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种α
‑
变形菌门甲基营养菌的突变株，其特征在于，该突变株以α
‑
变形菌门甲基营养菌为基础，通过蛋白质氨基酸序列突变技术、核苷酸序列突变技术或其他类似突变技术，使该α
‑
变形菌门甲基营养菌的磷酸核糖焦磷酸激酶发生突变，以降低磷酸核糖焦磷酸激酶催化活性。2.一种α
‑
变形菌门甲基营养菌的改造菌株，其特征在于，该改造菌株以α
‑
变形菌门甲基营养菌为基础，通过现代分子生物学技术降低其磷酸核糖焦磷酸激酶基因的转录水平或翻译水平。3.一种α
‑
变形菌门甲基营养菌的工程菌，其特征在于，该工程菌以α
‑
变形菌门甲基营养菌为基础，通过质粒基因过表达技术，或通过增加α
‑
变形菌门甲基营养菌的基因组上目标基因拷贝数，或通过基因组上基因元件替换改造技术，或采用其他类似分子生物学技术，提高α
‑
变形菌门甲基营养菌的磷酸酮醇酶代谢途径相关基因的表达水平即可，以增加磷酸酮醇酶代谢途径的代谢通量。4.权利要求1所述的α
‑
变形菌门甲基营养菌的突变株或权利要求2所述的α
‑
变形菌门甲基营养菌的改造菌株或权利要求3所述的α
‑
变形菌门甲基营养菌的工程菌中的一种或多种组合在植物生长中的应用。5.权利要求1所述的α
‑
变形菌门甲基营养菌的突变株或权利要求2所述的α
‑
变形菌门甲基营养菌的改造菌株或权利要求3所述的α
‑
变形菌门甲基营养菌的工程菌中的一种或多种组合在提高其寡碳源上的生长能力或...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨松，周狄霏，张聪，宋亚珍，王浩然，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：