用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重STR分型的引物及其应用、鉴别方法组成比例

本发明专利技术公开了一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重STR分型的引物，其包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；其序列如SEQ ID NO：1～8所示。本发明专利技术还公开了上述引物的应用，基于该引物的试剂盒，以及基于该引物的鉴别方法。实施本发明专利技术，可同时有效鉴别乌梢蛇、王锦蛇、灰鼠蛇和百花锦蛇。灰鼠蛇和百花锦蛇。灰鼠蛇和百花锦蛇。

【技术实现步骤摘要】
用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重STR分型的引物及其应用、鉴别方法


[0001]本专利技术涉及中药鉴别
，尤其涉及一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重STR分型的引物及其应用、鉴别方法。

技术介绍

[0002]我国蛇类物种约有两百余种，其中有20余种为常见蛇类，包括蕲蛇Agkistrodon acutus、乌梢蛇Zaocys dhumnades、金钱白花蛇Bungarus multicinctus、金环蛇Bungarus fasciatus、滑鼠蛇Ptyas mucosus、圆斑蝰Daboia russelii、眼镜蛇Naja naja、赤链蛇Lycodon rufozonatus、王锦蛇Elaphe carinata、灰鼠蛇Ptyas korros、短尾蝮蛇Gloydius brevicaudus、黑眉锦蛇Elaphe taeniura、百花锦蛇Elaphe moellendorffi等，其多数不具有临床药效。由于多种蛇类形态近似，药材鉴别困难，特别是加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，尤其是经过水提取制成标准汤剂，进一步加工成配方颗粒后，在失去药材性状后，更难以进行有效的鉴别。
[0003]一些研究指出，可采用PCR法(聚合酶链式反应法)对乌梢蛇药材进行鉴定。然而，标准汤剂、中药配方颗粒中往往含有一定比例的辅料，导致现有的PCR法难以适用。再者，标准汤剂、中药配方颗粒在制备过程中，往往需要加热提取，导致DNA降解，难以存留超过200bp的DNA片段，导致现有方法检测精度低。此外，现有的PCR法往往只能实现单个种类蛇的鉴定，效率较低。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重STR分型的引物，其可同时有效鉴别乌梢蛇、王锦蛇、灰鼠蛇和百花锦蛇。
[0005]本专利技术还要解决的技术问题在于，提供一种上述引物的应用。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题在于，提供一种基于上述引物的鉴别方法。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重STR分型的引物，其包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；
[0008]其中，所述第一引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；
[0009]所述第二引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示；
[0010]所述第三引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：5所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：6所示；
[0011]所述第四引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：7所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：8所示。
[0012]相应的，本专利技术还公开了上述引物在(1)或(2)中的应用：
[0013](1)鉴别待测样品是否为乌梢蛇、百花锦蛇、王锦蛇和/或灰鼠蛇；
[0014](2)制备用于鉴别乌梢蛇、百花锦蛇、王锦蛇和/或灰鼠蛇的试剂盒。
[0015]作为上述技术方案的改进，所述乌梢蛇为药材、标准汤剂或中药配方颗粒；
[0016]所述百花锦蛇为药材、标准汤剂或中药配方颗粒；
[0017]所述王锦蛇为药材、标准汤剂或中药配方颗粒；
[0018]所述灰鼠蛇为药材、标准汤剂或中药配方颗粒。
[0019]相应的，本专利技术还公开了上述的引物在(1)或(2)中的应用：
[0020](1)鉴别待测样品是否含有乌梢蛇、百花锦蛇、王锦蛇和/或灰鼠蛇；
[0021](2)制备用于鉴别待检测样品是否含有乌梢蛇、百花锦蛇、王锦蛇和/或灰鼠蛇的试剂盒。
[0022]相应的，本专利技术还公开了一种试剂盒，其包括上述的引物。
[0023]相应的，本专利技术还公开了一种基于上述的引物的鉴别方法，其包括：
[0024]提取待检测样品的基因组DNA；
[0025]以所述基因组DNA为模板，采用上述的引物进行PCR扩增，若扩增产物中含有130
‑
135bp的DNA特征峰，则待检测样品含有乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂和/或乌梢蛇中药配方颗粒；
[0026]若扩增产物中含有180
‑
185bp的DNA特征峰，则待检测样品含有王锦蛇药材、王锦蛇标准汤剂和/或王锦蛇中药配方颗粒；
[0027]若扩增产物中含有195
‑
198bp的DNA特征峰，则待检测样品含有灰鼠蛇药材、灰鼠蛇标准汤剂和/或灰鼠蛇中药配方颗粒；
[0028]若扩增产物中含有245
‑
250bp的DNA特征峰，则待检测样品含有百花锦蛇药材、百花锦蛇标准汤剂和/或百花锦蛇中药配方颗粒。
[0029]作为上述技术方案的改进，提取待检测样品的基因组DNA的方法如下：
[0030]取待检测样品，加入CTAB沉淀液、蛋白酶K沉淀提取2～3次；取沉淀物加入CTAB提取液、β
‑
巯基乙醇提取，然后加入氯仿
‑
异戊醇萃取2～3次；取萃取后上清液，加入异丙醇或异丙醇
‑
乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待检测样品的基因组DNA。
[0031]作为上述技术方案的改进，提取待检测样品的基因组DNA的方法如下：
[0032]取待检测样品0.3～0.8g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8mL的CTAB沉淀液、15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在50～60℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μL CTAB沉淀液、15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在50～60℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；取沉淀加入800～1000μL CTAB提取液，5～15μLβ
‑
巯基乙醇，混合均匀，在60～70℃加热100～150min，冷却至室温后取上清液，加入等体积的氯仿
‑
异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液700～800μL，再加入等体积的氯仿
‑
异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液400～500μL，加入等体积的异丙醇或异丙醇
‑
乙酸钠混合液，于
‑
30～
‑
20℃静置30～60min，离心后弃去上清液，再用乙醇洗涤沉淀2～4次，弃去上清液，沉淀于35～38℃孵育20～40min，待乙醇挥发后，加入30～50μL灭菌水溶解，即得到待检测样品的基因组DNA。
[0033]作为上述技术方案的改进，所述CTAB沉淀液包括CTAB、Tris
‑
HCl、EDTA和水；其中，CTAB的浓度为1～3％(w/v)，Tris
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HCl的浓度为80～120mmo本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重STR分型的引物，其特征在于，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；其中，所述第一引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；所述第二引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示；所述第三引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：5所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：6所示；所述第四引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：7所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：8所示。2.如权利要求1所述的引物在(1)或(2)中的应用：(1)鉴别待测样品是否为乌梢蛇、百花锦蛇、王锦蛇和/或灰鼠蛇；(2)制备用于鉴别乌梢蛇、百花锦蛇、王锦蛇和/或灰鼠蛇的试剂盒。3.如权利要求2所述的应用，所述乌梢蛇为药材、标准汤剂或中药配方颗粒；所述百花锦蛇为药材、标准汤剂或中药配方颗粒；所述王锦蛇为药材、标准汤剂或中药配方颗粒；所述灰鼠蛇为药材、标准汤剂或中药配方颗粒。4.如权利要求1所述的引物在(1)或(2)中的应用：(1)鉴别待测样品是否含有乌梢蛇、百花锦蛇、王锦蛇和/或灰鼠蛇；(2)制备用于鉴别待检测样品是否含有乌梢蛇、百花锦蛇、王锦蛇和/或灰鼠蛇的试剂盒。5.一种试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的引物。6.一种基于如权利要求1所述的引物的鉴别方法，其特征在于，包括：提取待检测样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增，若扩增产物中含有130
‑
135bp的DNA特征峰，则待检测样品含有乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂和/或乌梢蛇中药配方颗粒；若扩增产物中含有180
‑
185bp的DNA特征峰，则待检测样品含有王锦蛇药材、王锦蛇标准汤剂和/或王锦蛇中药配方颗粒；若扩增产物中含有195
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198bp的DNA特征峰，则待检测样品含有灰鼠蛇药材、灰鼠蛇标准汤剂和/或灰鼠蛇中药配方颗粒；若扩增产物中含有245
‑
250bp的DNA特征峰，则待检测样品含有百花锦蛇药材、百花锦蛇标准汤剂和/或百花锦蛇中药配方颗粒。7.如权利要求6所述的鉴别方法，其特征在于，提取待检测样品的基因组DNA的方法如下：取待检测样品，加入CTAB沉淀液、蛋白酶K沉淀提取2～3次；取沉淀物加入CTAB提取液、β
‑
巯基乙醇提取，然后加入氯仿
‑
异戊醇萃取2～3次；取萃取后上清液，加入异丙醇或异丙醇
‑
乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待检测样品的基因组DNA。8.如权利要求6所述的鉴别方法，其特征在于，提取待检测样品的基因组DNA的方法如
下：取待检测样品0.3～0.8g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8mL的CTAB沉淀液、15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在50～60℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μL CTAB沉淀液、15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在50～60℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；取沉淀加入800～1000μL CTAB提取液，5～15μLβ
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巯基乙醇，混合均匀，在60～70℃加热100～150...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗宇琴，宋叶，魏梅，陈向东，孙冬梅，黄上书，范耀耀，潘礼业，
申请(专利权)人：广东一方制药有限公司，
类型：发明
国别省市：