一种外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法技术

本发明专利技术公开了一种外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法。本发明专利技术从外周血分离单个核细胞直接培养，可以最大限度利用有分化潜能的神经嵴干细胞吧，避免造成神经嵴干细胞的损失。本发明专利技术方法分离的样本来源于外周血，具有创伤小，成本低的特点，最重要的是相比较于从组织中提取神经嵴源细胞，外周血来源提取的细胞可以作为一类生物标记物运用在临床上。胞可以作为一类生物标记物运用在临床上。胞可以作为一类生物标记物运用在临床上。

【技术实现步骤摘要】
一种外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法。

技术介绍

[0002]神经嵴源细胞是一种由胚胎外胚层细胞在发育过程中产生的暂时性的细胞群，能产生多种类型的细胞。该细胞群起源于神经管边缘的外胚层，经过上皮间充质(epithelial
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to
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mesenchymal transition，EMT)转换后，可广泛迁移到身体的不同部位从而形成了大量不同的组织和器官(Alkobtawi M,Ray H,Barriga E H,et al.Characterization of Pax3 and Sox10 transgenic Xenopus laevis embryos as tools to study neural crest development[J].Developmental biology,2018,444:S202
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S208.)。神经嵴源细胞迁移至目标组织后会以神经嵴干细胞的状态维持其多能性，而组织中的神经嵴干细胞则又进一步促进神经嵴源衍生物的生成。已从成体哺乳动物的肠道、心脏、眼角膜、骨髓等均有发现神经嵴源细胞，并且成功把神经嵴源细胞从组织中提取出来原代培养用于神经嵴源细胞方面的实验研究。
[0003]神经嵴源细胞不仅具有干细胞特征，而且也参与组织修复过程。有研究结果表明，在不同的神经嵴源衍生的成体组织应对损伤或者应激时通过神经嵴细胞衍生的特化细胞去分化或者激活残留在组织中具有神经嵴干细胞特征的细胞应对。神经嵴源细胞也可以通过旁分泌的信号方式来修复组织(Parfejevs V,Antunes AT,Sommer L.Injury and stress responses of adult neural crest
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derived cells.Dev Biol.2018；444Suppl 1:S356
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S365.doi:10.1016/j.ydbio.2018.05.011)。
[0004]mT/mG；Wnt1
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Cre小鼠是由Wnt1
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Cre转基因小鼠与mT/mG双荧光报告小鼠杂交得来。Wnt1
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Cre转基因小鼠系被广泛用于研究神经嵴及其衍生物，mT/mG双荧光报告小鼠在Cre发生重组前，其细胞膜表面被标记为tdTomato蛋白，因而发红色荧光；当与Wnt1
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Cre转基因小鼠杂交时，在Wnt1基因调控下，Cre重组酶会剪掉位于tdTomato序列旁边的两个Loxp位点，因而与EGFP序列连接，进而表达EGFP蛋白，故而细胞膜此时发绿光。所以，在mT/mG；Wnt1
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Cre小鼠体内，神经嵴来源细胞均会被标记为EGFP蛋白发绿光(Muzumdar MD,Tasic B,Miyamichi K,Li L,Luo L.A global double
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fluorescent Cre reporter mouse.Genesis.2007；45(9):593
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605.doi:10.1002/dvg.20335)。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的神经嵴源细胞获取较为麻烦，且创伤大等问题，本专利技术提供一种外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法。
[0006]一种外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法，从待分离对象的外周血中分离获取。
[0007]优选的，待分离对象为实验动物。
[0008]更优选的，实验动物为实验用的小鼠、大鼠或猴。
[0009]更优选的，所述神经嵴源细胞的分离获取方法，包括以下步骤：
[0010](1)取外周血，用外周血单个核细胞分离液分离获得白膜层细胞；
[0011](2)加入红细胞裂解液裂解红细胞；
[0012](3)离心收集细胞即为所述神经嵴源细胞。
[0013]进一步优选的，实验动物为小鼠，取外周血时采用眼眶静脉采血。
[0014]进一步优选的，实验动物为小鼠时，使用由Wnt1
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Cre转基因小鼠和mT/mG双荧光报告小鼠杂交筛选获得的mT/mG；Wnt1
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Cre小鼠。
[0015]进一步优选的，由二氧化硅诱导mT/mG；Wnt1
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Cre小鼠矽肺纤维化后再取外周血并分离获取神经嵴源细胞。
[0016]进一步优选的，所述外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法，具体步骤为：
[0017](1)采血获取抗凝血1ml，PBS盐溶液与外周血体积比1∶1稀释；
[0018](2)将稀释后的血液缓慢加入到装有3ml的小鼠外周血单个核细胞分离液液面上；
[0019](3)400g离心30min，离心温度设置为20℃；
[0020](4)取白膜层细胞至少800μl，加入PBS至14ml；
[0021](5)300g离心10min；
[0022](6)弃上清，加入3ml红细胞裂解液轻轻吹打混匀细胞，室温裂解2min；
[0023](7)400g离心5min，离心温度设置为4℃；
[0024](8)弃红色上清，加入10ml PBS轻轻吹打混匀细胞；
[0025](9)400g离心3min；
[0026](10)弃上清，重复步骤(9)和(10)使用PBS清洗细胞一次；
[0027](11)使用新配置的DMEM/F12培养基重悬所得细胞，并进行细胞计数；
[0028](12)将所得细胞进行培养，体外培养方式：细胞接种三天后换液，前两周每3
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4天进行半定量换液，当细胞汇合度达80％时，进行消化传代，之后调整为一周换液一次，6周后得到神经嵴源细胞。
[0029]本专利技术方法具备如下优点：
[0030]本专利技术方法分离的神经嵴源细胞已经被EGFP标记，在488发波长激发下，细胞表面会发出绿色荧光信号。因而容易分辨。
[0031]本专利技术从外周血分离单个核细胞直接培养，可以最大限度利用有分化潜能的神经嵴干细胞，避免造成神经嵴干细胞的损失。
[0032]本专利技术方法为小鼠外周血神经嵴源细胞的分离和培养建立了方法学，为此类研究奠定了基础。
[0033]本专利技术方法分离的样本来源于外周血，具有创伤小，成本低的特点，最重要的是相比较于从组织中提取神经嵴源细胞，外周血来源提取的细胞可以作为一类生物标记物运用在临床上。
附图说明
[0034]图1为mT/mG；Wnt1
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Cre转基因小鼠的产生原理。
[0035]图2为mT/mG；Wnt1
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Cre转基因小鼠基因型，方框所选代表该小鼠的基因型。
[0036]图3为mT/mG；Wnt1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法，其特征在于，从待分离对象的外周血中分离获取。2.根据权利要求1所述外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法，其特征在于，待分离对象为实验动物。3.根据权利要求2所述外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法，其特征在于，实验动物为实验用的小鼠、大鼠或猴。4.根据权利要求2所述外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取外周血，用外周血单个核细胞分离液分离获得白膜层细胞；(2)加入红细胞裂解液裂解红细胞；(3)离心收集细胞即为所述神经嵴源细胞。5.根据权利要求4所述外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法，其特征在于，实验动物为小鼠，取外周血时采用眼眶静脉采血。6.根据权利要求4所述外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法，其特征在于，实验动物为小鼠时，使用由Wnt1
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Cre转基因小鼠和mT/mG双荧光报告小鼠杂交筛选获得的mT/mG；Wnt1
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Cre小鼠。7.根据权利要求6所述外周血来源的神经嵴源细胞的分离获取方法，其特征在于，由二氧化硅诱导mT/mG；Wnt1

【专利技术属性】
技术研发人员：楼建林，李泳欣，冯玲芳，龚晓雪，董小雯，姚佳慧，黄婧，刘爽，徐彪，秦瑶，吴帆，
申请(专利权)人：杭州医学院，
类型：发明
国别省市：