一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽及其表达纯化方法和应用技术

一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽及其表达纯化方法和应用，涉及基因工程技术领域；步骤包括：S1，在重组SOD酶融合多肽中接入几丁质结合域，并在所述几丁质结合域的C端加入HRV 3C蛋白酶，得到改性多肽，设计对应的cDNA序列；S2，将所述cDNA序列接入载体质粒中，得到重组质粒；S3，将所述重组质粒电转入感受态表达菌株中培养并诱导表达，通过几丁质树脂纯化，洗脱，得到高稳定性的重组SOD酶融合多肽。本发明专利技术的一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，采用耐热性强的SOD突变体和活性肽融合表达，以SOD突变体作为伴体使活性肽具有耐高温和延缓降解的性能，提高稳定性。提高稳定性。提高稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽及其表达纯化方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽及其表达纯化方法和应用。

技术介绍

[0002]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)可用于催化超氧阴离子与氢反应，产生氧气和过氧化氢，是一种重要抗氧化剂，在保护细胞免受氧自由基的毒性方面发挥着关键作用。SOD常以铜和锌、或锰、铁、或镍作为辅助因子的形式存在；几乎所有真核细胞的细胞内都含有带有铜和锌的超氧化物歧化酶(Cu
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Zn
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SOD，SOD1)；几乎所有的线粒体和许多细菌(如大肠杆菌)均含有结合锰的超氧化物歧化酶(Mn
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SOD，SOD2)，研究表明，SOD2可用来清除对皮肤造成损害的自由基，减少肌成纤维细胞的表型逆转来减少纤维化。
[0003]活性因子，包含三对二硫键(Cys6
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Cys20,Cys14
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Cys31,Cys33
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Cys42)，二硫键形成产生三个结构环，通过与其受体结合，刺激细胞生长、增殖和分化。根据Hang
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Cheol Shin等人对活性因子定点突变研究，把L8S，I38C，D46C突变增加活性因子其自身热稳定性，与野生型活性因子相比圆二色(CD)相变温度Tm值从76℃提高到约87℃，可能与其增加了一二硫键有关，该突变体60℃处理5天，80％以上的突变体分子维持结构稳定(CD分析)。但增加二硫键会增加EGF分子合成中正确折叠，形成活性高级结构的难度，在用大肠杆菌等表达过程中可能会引入包涵体。根据Mount C D及Song Yub Shin等人研究，活性因子的N端2
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6位氨基酸或C端48
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53位氨基酸删去对其与受体亲和力及促细胞生长活性无显著影响，在小鼠和人的尿液中也存在2
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53,1
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52，1
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51.1
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50氨基酸等结构。
[0004]无论是SOD还是活性因子，稳定性对其活性和应用都至关重要，故有必要研究其突变位点以期提高多肽的稳定性，同时在多肽表达纯化的过程中，酶与纯化材料之间缺乏特异性，需要对酶进行预处理，预处理不仅会造成酶的损失，减低产率，而且会对其活性造成影响。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，其特异性强，纯化效率高，得到的融合多肽的稳定性强，活性高。
[0006]本专利技术的目的之二在于提供一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽，具有稳定性高，耐热性强，不易降解的特点。
[0007]本专利技术的目的之三在于提供一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽在制备化妆品或功能性食品中的应用。
[0008]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：
[0009]一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，包括以下步骤：
[0010]S1，在氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重组SOD酶融合多肽中接入几丁质结合域，并在所述几丁质结合域的C端加入HRV 3C蛋白酶，得到改性多肽，设计对应的cDNA序列；
[0011]S2，将所述cDNA序列接入载体质粒中，得到重组质粒；
[0012]S3，将所述重组质粒电转入感受态表达菌株中培养并诱导表达，通过几丁质树脂纯化，洗脱，得到高稳定性的重组SOD酶融合多肽。
[0013]进一步地，所述重组SOD酶融合多肽包括SOD突变体和活性肽，SOD突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0014]进一步地，所述SOD突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的SOD酶定点突变而成，所述定点突变包括：将所述SOD酶的第9位的天冬酰胺突变成丝氨酸，第15位的天冬酰胺突变成赖氨酸，第41位的脯氨酸突变成亮氨酸。
[0015]进一步地，所述重组SOD酶融合多肽的N端修饰有功能肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0016]进一步地，步骤S1中，所述改性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0017]进一步地，步骤S1中，所述cDNA序列包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
[0018]进一步地，步骤S3中，表达菌株为短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和酵母菌中的任一种。
[0019]本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：
[0020]一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽，由所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法所得。
[0021]本专利技术的目的之三采用如下技术方案实现：
[0022]一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的应用，所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽在制备化妆品或功能性食品中的应用。
[0023]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0024]本专利技术的一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，采用耐热性强的SOD突变体和活性肽融合表达，以SOD突变体作为伴体使活性肽具有耐高温和延缓降解的性能，提高稳定性；同时利用几丁质结合域，提高特异性强，纯化效率高，几丁质结合域的C端加入HRV 3C蛋白酶，以便于纯化后切除几丁质结合域纯化标签部分，得到的融合多肽的稳定性强，活性高，具有抗氧化、促愈合、抗衰老功效。
[0025]本专利技术的一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽，具有稳定性高，耐热性强，不易降解的特点。
[0026]本专利技术的一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽应用，其抗氧化、抗衰老性能优异，在制备化妆品或功能性食品中具有良好的应用前景。
附图说明
[0027]图1是本专利技术的实施例5中CBD
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PmPeSOD融合多肽的表达纯化分析图；图1A中，M:蛋白质分子量标准(上海碧云天生物技术有限公司，P0075)；泳道1
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9：依次是12h、24h、36h、48h、60h、3天、4天、5天、6天处理后的SDS
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PAGE凝胶电泳图；图1B中，泳道b1：含1M NaCl的TE洗脱液；泳道b2：40％硫酸铵沉淀后上清穿流液；泳道b3：含50mM NaCl的TE洗脱液；泳道b4：含50mM NaCl的TE洗脱后继续用纯水洗脱；图1C中，Cb1
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Cb4与图1B中泳道b1
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b4的对应。
具体实施方式
[0028]下面，结合具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
[0029]实施例1
[0030]在NCBI数据库中搜索SOD相关基因组测序，clastalX的对比结果显示：XP_011023491.1和XP_011023492.1多肽序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，在氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重组SOD酶融合多肽中接入几丁质结合域，并在所述几丁质结合域的C端加入HRV 3C蛋白酶，得到改性多肽，设计对应的cDNA序列；S2，将所述cDNA序列接入载体质粒中，得到重组质粒；S3，将所述重组质粒电转入感受态表达菌株中培养并诱导表达，通过几丁质树脂纯化，洗脱，得到高稳定性的重组SOD酶融合多肽。2.如权利要求1所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，其特征在于：所述重组SOD酶融合多肽包括SOD突变体和活性肽，SOD突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.如权利要求2所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，其特征在于：所述SOD突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的SOD酶定点突变而成，所述定点突变包括：将所述SOD酶的第9位的天冬酰胺突变成丝氨酸，第15位的天冬酰胺突变成赖氨酸，第41位的脯氨酸突变成亮氨酸。4.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佳，张广献，黄嘉文，
申请(专利权)人：广州美神生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：