一种双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针及其制备方法和用途，其中双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针的结构如下所示：本发明专利技术双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针在体外实验中表现出对NADH的良好响应性，具有良好的双光子吸收性能。细胞毒性测试表明该荧光探针的较低的生物毒性，共聚焦荧光显微成像实验表明该荧光探针对HeLa细胞成像性能好，可以有效定位细胞中的线粒体(定位系数为0.91)，适用于细胞内对NADH的共聚焦荧光成像。胞内对NADH的共聚焦荧光成像。胞内对NADH的共聚焦荧光成像。

【技术实现步骤摘要】
一种双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及一种双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针及其制备方法和用途，以实现荧光成像检测细胞线粒体内NADH水平的变化，具有高选择性、高灵敏度、低生物毒性等优点。

技术介绍

[0002]线粒体是真核细胞母系遗传的细胞质细胞器，是真核生物进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所。因此，线粒体在细胞新陈代谢、器官、组织以及整个生命体内都起着至关重要的作用。而还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)是活细胞中的重要辅酶，参与了许多细胞代谢过程，包括能量代谢、线粒体功能、免疫功能、生物合成、基因表达、细胞死亡和衰老。NADH的异常水平与肿瘤、癌症、缺血和糖尿病等都有关系。特别是，位于线粒体中的NADH对线粒体呼吸链产生ATP以及维持线粒体抗氧化防御系统和调节线粒体膜电位至关重要。线粒体内NADH水平异常会诱发线粒体功能障碍，产生活性氧(ROS)和DNA损伤，并与中风、阿尔茨海默氏症和帕金森病有关。此外，最近有报道称线粒体NADH在各种肿瘤癌症中过度表达。所以这突出表明，对活细胞中的NADH进行实时、动态监测对于调查和了解NADH对生理和病理过程的贡献至关重要。
[0003]迄今为止，已经开发了许多体外检测NADH的方法，包括酶循环测定法、电化学分析法、高效液相色谱法和毛细管电泳法。毛细管电泳。然而，这些方法在实时检测活体细胞和组织中的NADH水平的变化方面有局限性。荧光荧光探针由于其许多优点，如高灵敏度、高选择性、快速反应率、低检测限和易于操作等，已获得科学界的广泛关注。在过去的几十年里，人们的注意力集中在开发用于检测活细胞中的NADH的荧光荧光探针上，甚至是在体内。这些荧光探针已被成功地用于区分正常细胞和癌细胞，并通过天然抗氧化剂诱导的还原应激检测癌细胞死亡。双光子荧光探针具有低光毒性和光漂白性，组织穿透深度大等优点，所以，开发双光子荧光探针用于活细胞线粒体中NADH的检测，这将在疾病诊断和预防方面具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在提供一种双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种可以特异性靶向线粒体并对NADH专一性荧光响应的探针分子结构，以实现活细胞线粒体中荧光检测NADH，具有选择性高、灵敏度好、双光子吸收性能优良和光稳定性好等优点，细胞毒性测试表明本荧光探针的细胞相容性良好。
[0005]本专利技术双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针，简记为Mito
‑
FCC，以1,1,2
‑
三甲基
‑
1H
‑
苯并[e]吲哚盐和喹啉盐作为线粒体靶向单元，同时喹啉盐也为NADH的响应单元，其结构式如下所示：
[0006][0007]本专利技术双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0008]步骤1：将1g的1,1,2
‑
三甲基
‑
1H
‑
苯并[e]吲哚和1.36g的CH3I溶解在10mL的CH3CN中，25℃下搅拌24小时，反应完成后抽滤并用石油醚进行洗涤得到中间体1，1.47g，产率87.5％。
[0009]步骤2：将0.67g的中间体1和0.3g的3
‑
喹啉甲醛作为反应物，8mL无水乙醇作为溶剂，再滴加3滴哌啶作为催化剂，氩气氛围和温度60℃下反应6小时；反应完成后抽滤得到粗产物，然后用石油醚、乙醚和乙酸乙酯对粗产物进行洗涤得中间体2，0.60g，产率64％。
[0010]步骤3：将0.25g的中间体2和0.17g的三氟甲磺酸甲酯作为反应物，10mL二氯甲烷作溶剂，在氩气氛围和温度25℃下搅拌24小时；反应完成后抽滤得到粗产物，然后用石油醚、乙醚和二氯甲烷对粗产物进行洗涤得目标产物Mito
‑
FCC，0.253g，产率75.83％。
[0011]本专利技术双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针的合成路线如下所示：
[0012][0013]本专利技术双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针的用途，是用于制备检测活细胞线粒体内NADH水平变化的检测试剂。
[0014]所述检测试剂在580nm处的荧光强度与NADH浓度之间存在线性关系。
[0015]进一步地，所述检测试剂的检测限为0.26μM。
[0016]具体检测方法如下：
[0017]将本专利技术Mito
‑
FCC溶于DMSO中制得2mM的母液，各取15μL母液于3mL不同NADH浓度的PBS(pH＝7.4)溶剂中，获得Mito
‑
FCC(10μM)在不同NADH浓度测试液中的荧光和紫外谱图。随着NADH浓度的升高，Mito
‑
FCC的吸光度在557nm升高、360nm降低，荧光在580nm处不断升高。溶液中NADH浓度和荧光强度呈现良好的线性关系(R2＝0.977)。然后，在PBS(pH＝7.4)缓冲液中还测试了Mito
‑
FCC的选择性和响应时间，发现Mito
‑
FCC受其他干扰物的影响
较小，表明其良好的选择性，并且响应时间在10min左右达到最大的荧光强度。因此，以上结果表明了Mito
‑
FCC在溶液中有效响应NADH，可以作为检测NADH的荧光探针。然后，又使用线粒体的商业染料(Mito
‑
Tracker Green)与Mito
‑
FCC在HeLa细胞中进行共定位研究。结果表面Mito
‑
FCC与Mito
‑
Tracker Green的荧光图像重叠良好，并且Mito
‑
FCC与Mito
‑
Tracker Green的Pearson共定位系数计算为0.91。以上结果表明，Mito
‑
FCC可以很好地定位于活细胞的线粒体。
[0018]本专利技术双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针，在溶液和细胞中都对NADH具有良好响应能力。细胞毒性测试表明Mito
‑
FCC的细胞相容性良好，共聚焦荧光显微成像实验表明Mito
‑
FCC可以有效定位线粒体(定位系数为0.91)，适用于线粒体共聚焦荧光成像和原位检测。
附图说明
[0019]图1是Mito
‑
FCC(10μM)在不同NADH浓度(0
‑
90μM)下的(a)紫外吸收光谱和(b)荧光发射光谱及在加入NADH前后溶液颜色和荧光变化图。
[0020]图2是Mito
‑
FCC(10μM)加入(a)NADH(100μM)前后的时间响应曲线图和(b)100μM各种分析物的选择性测试柱状图。
[0021]图3是Mito
‑
FCC(10μM)的荧光强度(I
580nm
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针，简记为Mito
‑
FCC，其特征在于其结构式如下所示：2.一种权利要求1所述的双盐结构的线粒体靶向双光子荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：将1,1,2
‑
三甲基
‑
1H
‑
苯并[e]吲哚和CH3I溶解在CH3CN中，25℃下搅拌24小时，反应完成后抽滤并用石油醚洗涤得到中间体1；步骤2：将中间体1和3
‑
喹啉甲醛作为反应物，无水乙醇作为溶剂，再滴加哌啶作为催化剂，氩气氛围下于60℃反应6小时；反应完成后抽滤得到粗产物，然后用石油醚、乙醚和乙酸乙酯对粗产物进行洗涤得中间体2；步骤3：将中间体2和三氟甲磺酸甲酯作为反应物，二氯甲烷作溶剂，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯燕，陈德宝，欧家乐，周惠敏，孟祥明，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：