基于脱氧核酶微量热泳分析目标物的探针和方法技术

本发明专利技术提供了基于荧光染料标记的RNA剪切脱氧核酶探针的微量热泳分析脱氧核酶辅助因子目标物方法，可实现灵敏快速分析检测铅离子和小分子。目标物存在时激活脱氧核酶剪切底物的活性，微量热泳分析检测信号产生显著变化，本发明专利技术的方法检测铅离子的检测限达到了49pM或6pM，而检测L型组氨酸的检测限达到了3.9μM。本发明专利技术的方法具有如下优势，灵敏度高、检测迅速、所需样品体积小、通量高可同时检测16个样品，无需固定分子，不需要分离，检测只需要一步温育。同时脱氧核酶分子稳定性好，选择性强，催化活性高，保证了方法的高选择性和高灵敏度。度。

【技术实现步骤摘要】
基于脱氧核酶微量热泳分析目标物的探针和方法


[0001]本专利技术生物检测领域，具体涉及基于脱氧核酶微量热泳分析目标物的探针和方法。

技术介绍

[0002]脱氧核酶(DNAzyme)是具有催化活性的DNA序列，可以催化多种反应，如RNA分子的剪切、RNA分子的连接、DNA的连接、DNA的剪切、氧化还原反应等。RNA剪切型的脱氧核酶可在辅助因子存在时，催化剪切含有特定RNA位点的底物分子，基于这一特点，RNA剪切型的脱氧核酶可以被用于开发检测辅助因子的方法。这些辅助因子通常是金属离子、小分子等。针对某种辅助因子的RNA剪切型的脱氧核酶可以利用体外筛选的方法得到。由于RNA剪切型的脱氧核酶具有催化剪切对应的底物序列的功能，利用RNA剪切型的脱氧核酶检测辅助因子的方法，可实现检测信号放大，具有高灵敏度。目前常用的基于RNA剪切型脱氧核酶检测辅助因子的方法包括电化学检测法、荧光检测法、比色法等。但是电化学方法需要将脱氧核酶或底物分子固定到电极表面、样品用量大、电化学信号重现性较差、另外检测通量比较低，一次只能分析一个样品或几个样品，修饰电极的制备耗时长。荧光检测方法往往需要在脱氧核酶或底物上同时标记荧光染料分子和猝灭基团(或使用纳米材料如纳米金、石墨烯等)，多个功能团的修饰增加了成本，另外，荧光信号强度(这里是指荧光强度fluorescence intensity信号)的测定容易受多种因素影响，检测信号容易产生波动。
[0003]微量热泳分析是一种新型的表征分子相互作用的技术，可以灵敏测定毛细管溶液中荧光分子对于红外激光加热升温的响应。这种技术操作简单、灵敏、快速、样品用量少、通量高、无需分离和固定分子。微量热泳分析通常采用荧光染料标记的亲和配体和分子间的相互作用等，根据荧光染料标记的亲和配体与分子结合前后产生的信号变化来实现亲和力的测定，这一技术已经在很多领域有广泛的应用。微量热泳分析在检测目标物方面也显示出潜力，但往往需要利用可与待测物结合的荧光染料标记的亲和配体，缺乏有效的信号放大手段，限制了检测灵敏度的提高。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种基于脱氧核酶微量热泳分析目标物的方法和相应的荧光染料标记探针。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一方面，本专利技术提供用于目标物的微量热泳分析的探针，其特征在于，所述探针为：
[0007]a.将RNA剪切脱氧核酶和其底物序列偶联在一起所形成的序列，所形成的序列一端标记有荧光染料；或
[0008]b.包括RNA剪切脱氧核酶和其底物序列，且所述RNA剪切脱氧核酶和其底物序列中的一个标记有荧光染料。
[0009]另一方面，本专利技术提供目标物的微量热泳分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0010]a.将上述探针与待测目标物在缓冲液中温育；
[0011]b.通过微量热泳分析产生的信号变化，并根据信号变化获得待测目标物的浓度。
[0012]另一方面，本专利技术提供用于目标物的微量热泳分析的试剂盒，其特征在于，包括上述探针和缓冲液。
[0013]在一些实施方案中，所述荧光染料为荧光素分子或四甲基罗丹明。
[0014]在一些实施方案中，所述RNA剪切脱氧核酶如SEQ ID NO:3所示，所述底物序列如SEQ ID NO:2所示，所述待测目标物为铅离子。
[0015]在一些实施方案中，所述RNA剪切脱氧核酶如SEQ ID NO:6所示，所述底物序列如SEQ ID NO:5所示，所述待测目标物为L型组氨酸。
[0016]在一些实施方案中，所述探针如SEQ ID NO:1所示，所述待测目标物为铅离子。
[0017]在一些实施方案中，所述探针如SEQ ID NO:4所示，所述待测目标物为L型组氨酸。
[0018]在一些实施方案中，所述RNA剪切脱氧核酶和所述底物序列通过多个碱基偶联在一起，优选地，所述多个碱基为TTTTT。
[0019]在一些实施方案中，所述缓冲液为含有或镁离子和/或钠离子和/或钾离子的Tris
‑
HCl缓冲液。
[0020]在一些实施方案中，所述镁离子来自MgCl2,所述MgCl2浓度为0
‑
10mM，优选为2mM。
[0021]在一些实施方案中，所述钠离子来自NaCl，所述NaCl浓度为0
‑
1000mM，优选为200
‑
500mM。
[0022]在一些实施方案中，所述钾离子来自KCl，所述KCl浓度为1
‑
1000mM，优选为200
‑
600mM，更优选为400mM。
[0023]在一些实施方案中，所述缓冲液的pH为6
‑
9，例如6.0、6.5、7.0、7.5、7.8、8.0、8.5、9.0，优选为pH 7.5。
[0024]在一些实施方案中，所述温育温度范围为4℃至37℃，优选温度是20℃或25℃。
[0025]在一些实施方案中，所述温育的时间为15
‑
90分钟，优选的温育时间为15
‑
60分钟。
[0026]本专利技术的分析方法可以通过以下方案1和方案2来实现。
[0027]方案1：将RNA剪切脱氧核酶和其底物序列通过若干个碱基偶联在一起，将荧光染料标记到这个DNA序列的3
’
末端或5
’
末端。当待测目标物存在时，脱氧核酶的活性被激活，催化剪切对应的底物序列，分子结构产生改变，进行微量热泳分析时，微量热泳分析的信号产生明显的信号变化。根据微量热泳分析检测信号的变化，可以实现对辅助因子目标物(如铅离子、小分子L
‑
型组氨酸等)的检测。
[0028]方案2：采用分开的两个DNA序列，分别为RNA剪切脱氧核酶和其对应的底物序列分子，两者中的一个序列末端标记上荧光染料分子。检测目标物时，将两者按照1：1的比例混合，与不同浓度的待测目标物温育，待测物的存在激活RNA剪切脱氧核酶的活性，切割底物，然后进行微量热泳分析，根据微量热泳检测信号产生变化进而实现对辅助因子目标物(如铅离子、小分子L
‑
型组氨酸等)的检测。
[0029]在一些实施方案中针对铅离子的检测，相应的DNA序列如下。
[0030]SEQ ID NO:1
‑
3'FAM，5'
‑
CTA T rA GGA AGA GAT GAT GTC TGT TTT TT A CAG ACA TCA TCT CTG AAG TAG CGC CGC CGT ATA G
‑
3'(SEQ ID NO:1)，其3
’
端标记荧光素分
子(简称FAM)，其中下划线部分对应脱氧核酶的底物分子序列，序列中的rA代表RNA核苷(只有rA是RNA核苷)，斜体部分为脱氧核酶分子，两者之间为若干T碱基，将脱氧核酶分子和其底物分子两者本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于目标物的微量热泳分析的探针，其特征在于，所述探针为：a.将RNA剪切脱氧核酶和其底物序列偶联在一起所形成的序列，所形成的序列一端标记有荧光染料；或b.包括RNA剪切脱氧核酶和其底物序列，且所述RNA剪切脱氧核酶和其底物序列中的一个标记有荧光染料。2.目标物的微量热泳分析方法，其特征在于，包括以下步骤：a.将根据权利要求1所述的探针与待测目标物在缓冲液中温育；b.通过微量热泳分析产生的信号变化，并根据信号变化获得待测目标物的浓度。3.用于目标物的微量热泳分析的试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1所述的探针和缓冲液。4.根据权利要求1所述的探针、根据权利要求2所述的方法或根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为荧光素分子或四甲基罗丹明。5.根据权利要求1所述的探针、根据权利要求2所述的方法或根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA剪切脱氧核酶如SEQ IDNO:3所示，所述底物序列如SEQ ID NO:2所示，所述待测目标物为铅离子。6.根据权利要求1所述的探针、根据权利要求2所述的方法或根据权利要求3所述的试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵强，于皓，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：