一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及转化方法技术

本发明专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及转化方法，属于基因工程技术领域。通过使用木糖诱导型启动子P

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及转化方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及转化方法。

技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌是一种重要的工业微生物，其遗传学和生理学已被深入研究。枯草芽孢杆菌能直接将目的基因产物分泌到培养基中，且表达产物可溶、可正确折叠并具有生物活性，同时表达产物与胞内蛋白分离，无需破碎细胞，有利于分离和纯化，是应用极为广泛的基因工程表达宿主。
[0003]转化是指细菌摄取外界环境中DNA的过程。枯草芽孢杆菌转化机制研究表明，细胞感受外界信号后经过一系列调控途径诱导感受态形成因子ComK的产生，ComK再调控一系列后期感受态形成基因的表达，这些基因编码细胞膜上识别并接受外源DNA的复合体和胞内保护酶等产物，而所有转化的发生都需要细胞处于感受状态，才有可能转化成功。因此，制备性能良好的感受态细胞是实现枯草芽孢杆菌转化的关键步骤。
[0004]然而，枯草芽孢杆菌的转化效率远远低于大肠杆菌等宿主，这限制了其在蛋白质工程以及代谢改造中的应用。在枯草芽孢杆菌工程菌的构建过程中，能够自发形成感受态的菌株极少，而且感受态持续时间短暂，分子克隆效率低。
[0005]感受态效率受到信号转导网络严密的调控。感受态转录因子ComK在其中扮演着重要的作用。ComK的表达受到AbrB、Rok(Ykuw)、CodY等转录因子的抑制，同时也受到EdqSu双组分调控系统及ComK本身的正向调控。因此，提高枯草芽孢杆菌的感受态效率，可以从两个方面入手，一是敲除comK基因的抑制因子，二是过表达ComK正向调控因子。目前有研究证明这两种方式均可行，通过失活Rok的编码基因rok，可以使枯草芽孢杆菌BD630的转化效率提高5倍；通过将含有木糖启动子P
xylA
的comK基因导入枯草芽孢杆菌1A751，得到的枯草芽孢杆菌1A976对DNA的转化效率可以提高1000倍。除此之外，Xinzhi Li等(Preparation and transformation optimization for supercompetent B.subtilis SCK6 cells)通过改变培养基、诱导剂浓度、质粒类型等参数优化感受态制备的条件。具体地，用YN培养基替代常规LB培养基制备感受态，转化效率提高4倍左右；加入1.5％的木糖诱导2h，感受态的转化效率又提高2倍左右；用大肠杆菌GM272来源的质粒pDG1730使转化效率进一步提高3倍左右，达到106cfu/μg，相对于未优化前提高了2个数量级。
[0006]专利CN201911243090.6公开了一种促进枯草芽孢杆菌自然生长转化的培养基组合及其转化方法，通过优化培养基实现枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备，具体地，将枯草芽孢杆菌接种于LB培养基中振荡培养，随后将培养产物接种于优化后的第一培养基中震荡培养，待OD值达到特定值后与无菌的甘油混合，并低温冷冻，随后将产物融化，接种于优化后的第二培养基中培养，得到感受态细胞以进行自然转化。专利CN201910943271.3公开了一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法，转化过程包括将枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌ZK、DB104或WB600)接种至LB培养基中过夜，再接种于GM培养基中培养，加入细胞壁弱
化剂(由甘氨酸、丝氨酸和二硫苏糖醇组成)继续培养至OD值达到0.9，收集枯草芽孢杆菌，将其与质粒PHT01或PHT304混匀并进行电击，电击转化后热激，实现转化。专利CN201610297900.6公开了一种高转化率的枯草芽孢杆菌，其以枯草芽孢杆菌A164为宿主，将其中的中性蛋白酶基因nprE敲除，并替换为xylR
‑
PxylA
‑
comk表达单元。
[0007]异养型枯草芽孢杆菌3NA(Bacillus subtilis 3NA)是由Michel和Mille分离得到的spo0A突变株，并由Reuβ及其同事于2015年鉴定为枯草芽孢杆菌168及其亚种W23菌株的杂交种。该菌为非产芽孢菌株，在CDM中表现出较高的生长速率，是唯一一种在补料分批发酵过程中允许高细胞密度培养的芽孢杆菌菌株(细胞干重[CDW]高达75g/L)。这种独特的表型使枯草芽孢杆菌3NA菌株成为一种极好的生产生物分子的候选菌株。然而，有研究指出，枯草芽孢杆菌3NA被定性为不可转化菌株，其实际转化效率较低，与枯草芽孢杆菌168相当。这在很大程度上限制了枯草芽孢杆菌3NA的进一步开发应用。
[0008]目前关于如何提高枯草芽孢杆菌转化效率的研究非常之多，然而，在枯草芽孢杆菌3NA中DNA突变文库的克隆和转化并不像在大肠杆菌中那样容易操作且高效。目前较多使用的转化方法(两步法或高渗透压电穿孔法)皆耗时费力，操作繁琐，效率低下。因此，在枯草芽孢杆菌3NA中开发省力且转化效率足够高的转化方法十分重要。

技术实现思路

[0009]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及转化方法，以枯草芽孢杆菌为宿主，通过使用木糖诱导型启动子P
xylA
在基因组上过表达一个额外拷贝的comK基因获得一株转化效率提高的重组枯草芽孢杆菌，并进一步制备成感受态细胞，再通过对培养基种类、种子液培养时间、外源DNA添加用量、感受态中甘油添加量的优化，建立了一种高效、便捷的DNA转化方法，对枯草芽孢杆菌表达系统的应用和提高其生产性能具有重要意义。
[0010]本专利技术的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0011]S1、将转录因子comK基因转入枯草芽孢杆菌中，得到重组枯草芽孢杆菌，所述转录因子comK基因由木糖诱导型启动子P
xylA
调控表达；
[0012]S2、将S1中重组枯草芽孢杆菌活化，并接种于第一培养基中进行培养，获得种子液，将种子液接种于第二培养基中进行培养，加入木糖继续培养，诱导形成所述枯草芽孢杆菌感受态细胞；
[0013]其中，所述第一培养基和第二培养基同时为以下(1)
‑
(2)中的一种：
[0014](1)培养基的组成为：蛋白胨15
‑
25g/L，酵母粉1
‑
10g/L，牛肉膏1
‑
10g/L，NaCl 10
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20g/L，KH2PO
4 10
‑
20g/L，K2HPO
4 1
‑
10g/L；
[0015](2)培养基的组成为：蛋白胨10
‑
15g/L，酵母提取物20
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30g/L，甘油1
‑
10g/L，K2HPO
4 1
‑
5g/L，KH2PO
4 10
‑
15g/L。
[0016]进一步地，所述转录因子comK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0017]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将转录因子comK基因转入枯草芽孢杆菌中，得到重组枯草芽孢杆菌，所述转录因子comK基因由木糖诱导型启动子P
xylA
调控表达；S2、将S1中重组枯草芽孢杆菌活化，并接种于第一培养基中进行培养，获得种子液，将种子液接种于第二培养基中进行培养，向其中加入木糖，诱导形成所述枯草芽孢杆菌感受态细胞；其中，所述第一培养基和第二培养基同时为以下(1)
‑
(2)中的一种：(1)培养基的组成为：蛋白胨15
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25g/L，酵母粉1
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10g/L，牛肉膏1
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10g/L，NaCl 10
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20g/L，KH2PO
4 10
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20g/L，K2HPO
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10g/L；(2)培养基的组成为：蛋白胨10
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15g/L，酵母提取物20
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30g/L，甘油1
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10g/L，K2HPO
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5g/L，KH2PO
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘延峰，陈坚，堵国成，刘龙，李江华，吕雪芹，赵润芝，田荣臻，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：