雷西莫特和聚乙烯吡咯烷酮在联合制备分选绵羊精子上游液中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种雷西莫特和聚乙烯吡咯烷酮在联合制备分选绵羊精子上游液中的应用，该应用为非诊断方法或非治疗方法上的应用，具体用于在联合制备分选绵羊Y精子上游液，雷西莫特与绵羊X精子尾部TLR7/TLR8受体结合，从而限制X精子游动；Y精子的尾部没有TLR7/TLR8受体，则不会被限制；聚乙烯吡咯烷酮增加上游液的粘稠度，阻碍绵羊精子的游动，则雷西莫特和聚乙烯吡咯烷酮联合起到高效分选Y精子的作用，并且分选出高纯度、高质量的绵羊Y精子。高质量的绵羊Y精子。高质量的绵羊Y精子。

【技术实现步骤摘要】
雷西莫特和聚乙烯吡咯烷酮在联合制备分选绵羊精子上游液中的应用


[0001]本专利技术属于性别控制
，具体涉及一种雷西莫特(R848)与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在联合制备分选绵羊精子上游液(IVF)中的应用，从而达到高效分选Y精子的效果。

技术介绍

[0002]精子上游液一般在体外受精之前使用，将精子注入上游液底部，使精子自主游向液面。这一过程能起到精子活力筛选的作用，活力弱的精子则留在了上游液底部，上游液中的成分也能使精子获能，从而具备受精的能力。目前，精子上游液只能起到活力筛选与获能的作用，还无法起到X、Y精子分选性别控制的效果。
[0003]在性别控制
中，流式细胞分选技术较为常用，也是相对成熟的性别控制技术，该技术在奶牛育种上已经得到了广泛使用。当精子经过流式细胞仪时，或多或少会给精子带来一定损伤，并且绵羊精子相对于奶牛精子较小、较脆弱。绵羊精子用流式细胞仪分选后会给活力和完整性造成一定损伤。专利技术一种使精子被动分选转变为主动分选的方法尤为重要。
[0004]周正娜在学术文章中报道过利用R848分选小鼠精子，但Y精子的分选率只达到了63.3％，(周正娜,唐小云,周桂珍.R848处理小鼠精子对胚胎性别比率的影响[J].中国畜牧杂志,2021,57(10):145
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149.)并没有进一步提高该方法的分选率。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术中的不足，目的是提供一种雷西莫特和聚乙烯吡咯烷酮在联合制备分选绵羊精子上游液中的应用。
[0006]为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：
[0007]R848和PVP在联合制备分选绵羊精子上游液中的应用，该应用为非诊断方法或非治疗方法上的应用。其中，R848的分子结构为：
[0008][0009]PVP的分子结构为：
[0010][0011]R848和PVP在联合制备分选绵羊Y精子上游液中的应用，该应用为非诊断方法或非治疗方法上的应用。
[0012]进一步地，R848能与绵羊X精子尾部TLR7/TLR8受体结合，从而限制X精子游动。Y精子的尾部没有TLR7/TLR8受体，则不会被限制。
[0013]进一步地，PVP增加上游液的粘稠度，能起到一定的制动作用，进一步增加精子的游动阻力(Ff)。
[0014]进一步地，R848在上游液中的添加浓度为2μmol/L，PVP在上游液中的添加浓度为3％，能有效起到分选X、Y精子的效果。
[0015]本专利技术将分选出的Y精子进行体外受精，得到囊胚，并利用牙釉质基因(AMEL)进行单个胚胎的性别鉴定，证实了分选出的是Y精子。所以将R848于PVP在上游液中结合使用，能够起到高效分选Y精子的效果。
[0016]由于采用上述方案，本专利技术的有益效果是：
[0017]本专利技术R848能与X精子尾部TLR7/TLR8受体结合，限制X精子的游动，而Y精子的尾部没有TLR7/TLR8受体，则不会被限制。PVP能增加上游液的粘稠度，起到一定的制动作用，增加精子的游动阻力(Ff)，进一步限制了X精子的游动。因此一定浓度的R848与PVP能起到高效分选绵羊Y精子的作用，因此利用上游方法，使精子自主完成分选，并且分选出高纯度、高质量的绵羊Y精子。
附图说明
[0018]图1为本专利技术的R848和PVP在联合制备分选绵羊精子上游液流程图。
[0019]图2为本专利技术的实施例中不同精子尾部质膜TLR7/8受体示意图。
[0020]图3为本专利技术的实施例中不同精子上游分选示意图。
[0021]图4为本专利技术的实施例中绵羊的扩张囊胚图。
[0022]图5为本专利技术的实施例中AMEL基因片段巢式扩增结果图。
具体实施方式
[0023]本专利技术提供了一种R848和PVP在联合制备分选绵羊精子上游液中的应用。
[0024]图1为本专利技术的R848和PVP在联合制备分选绵羊精子上游液流程图。
[0025]为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。但本专利技术的保护范围并不局限于以下实施例。
[0026]以下实施例中的实验均在塔里木大学塔里木畜牧科技兵团重点实验室完成。
[0027]以下实施例中所述的实验精液、细胞来源：
[0028]绵羊精液利用假阴道法采自塔里木大学动物试验站；胚胎培养所需卵母细胞采自阿克苏市塔里木牛羊屠宰场，绵羊品种为多浪羊，屠宰后取卵巢，放入37℃加双抗的生理盐水中，立即拿回实验室用37℃生理盐水清洗，利用抽吸法收集卵母细胞，进行体外培养。
[0029]1.上游液的配制：按照表1、表2所示药品与剂量进行配制，R848在使用前加入并混匀。
[0030]2.精子上游分选：
①
将0.5mL上游液放入1.5mLEp管中，
②
将3mL上游液放入5mL圆底离心管中，将Ep管与离心管放入38℃，5％CO2培养箱中平衡2h。先将0.5mL精液与1.5mLEp
管中的0.5mL上游液缓慢混匀，放入38℃，5％CO2培养箱3min，使X精子尾部与R848充分结合，结合后进行离心(1500r/min，5min)，随即弃去上清液，沉淀精液约0.5mL。再将0.5mL精液用移液枪缓慢注入上游液底部，放入38℃，5％CO2培养箱中上游30min，需缓慢操作，切勿摇晃。在此过程中X精子尾部的R848受体与上游液中的R848结合，限制X精子的游动，较少的X精子也会被上游液中PVP所阻碍，只有活力充足的Y精子能游至上游液上层。如图2、图3(浅色为X精子，深色为Y精子)所示。
[0031]3.Y精子的收集：缓慢吸取约1mL的上清，切勿吸入底部的精液，加入新的离心管中。可根据实验所需精子密度进行离心(1500r/min，5min)后去上清。
[0032]4.体外受精：将收集到的一定浓度的Y精子与成熟的卵母细胞混合，使精子自主完成受精过程。
[0033]5.单个胚胎性别鉴定：体外受精后第6天收集胚胎，胚胎如图4所示，进行单个胚胎性别鉴定，引物如表3所示。取5μL胚胎裂解液，加入PCR管中，每个PCR管中加入一个胚胎，放入PCR仪中37℃孵育1h，95℃孵育10min，进行裂解。随后进行巢式PCR进行扩增。第一轮反应体系总体积25μL，包括12.5μL新贝Premix，1μL的上下游外围引物，5μL的胚胎裂解模板，补充无菌去离子水到25μL。反应条件：95℃，3min预变性；95℃，30s变性；62℃，30s退火；72℃，30s延伸；35个循环；72℃，5min最终延伸。第二轮反应体系总体积25μL，包括12.5μL新贝Premix，2μL的上下游内围引物，1μL的稀释第一轮产物为模板，补充无菌去离子水到25μL。反应条件：95℃，3min预变性；95℃，30s变性；62℃，30s退火；72℃，30s延伸；35个循环；72℃，5min最终延伸。结果如图5所示，若雄性胚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.雷西莫特和聚乙烯吡咯烷酮在联合制备分选绵羊精子上游液中的应用，该应用为非诊断方法或非治疗方法上的应用。2.雷西莫特和聚乙烯吡咯烷酮在联合制备分选绵羊Y精子上游液中的应用，该应用为非诊断方法或非治疗方法上的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述雷西莫特与绵羊X精子尾部TLR7/TLR8受体结合，从而限...

【专利技术属性】
技术研发人员：高庆华，黄飞，牛鹏，王洁茹，王杰，
申请(专利权)人：塔里木大学，
类型：发明
国别省市：