一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法，涉及体外核酸诊断技术领域。采用Taqman探针法和扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)相结合的方式，仅对SMN1基因设计对应的特异引物和探针，在SMN2基因存在的样本中能准确扩增SMN1基因而几乎不扩增SMN2基因，同时对于极少数具有较多拷贝SMN2基因的样本，在检测SMN1基因时依然能准确检出，结果基本不受SMN2基因干扰，实现了在不检测SMN2基因的情况下准确检测SMN1基因。检测SMN2基因的情况下准确检测SMN1基因。检测SMN2基因的情况下准确检测SMN1基因。

【技术实现步骤摘要】
一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及体外核酸诊断
，具体而言，涉及一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种常染色体隐性遗传病，在人群中的携带率为1/40
‑
1/50，患病率约为1/6000
‑
1/10000，在致死性常染色体隐性遗传病中排第2位，目前针对此病还没有有效的治疗手段。研究表明这种疾病主要由位于5q11.2
‑
q13.3上的运动神经元存活(SMN)基因发生缺失或突变所致，并且其中占95％以上由第7号外显子和/或第8号外显子发生大片段缺失，导致SMN蛋白无法正常表达，运动神经元凋亡，神经系统无法控制肌肉从而患病。
[0003]根据临床症状和发病年龄，可将脊髓性肌萎缩症(SMA)分为4类，其中I
‑Ⅲ
型又称为儿童型，I型患者最严重，通常活不过两岁，II型患者通常在1岁内起病，Ⅲ型一般在青春期前发病，Ⅳ型一般可活到成年，并且预后良好。
[0004]人运动神经元存活基因(SMN)包括端粒端的运动神经元存活基因1(SMN1)和着丝粒端的运动神经元存活基因2(SMN2)，两个基因均包含8个外显子，并且SMN1与SMN2高度同源，仅有几个碱基的不同，导致SMA的主要原因是SMN1基因存在缺陷，而SMN2基因主要与SMA临床症状的轻重有关。通常正常人每个细胞含有2个拷贝的SMN1基因，而SMN2基因拷贝数可以为0至多个，携带者因其中一个SMN1基因发生突变，从而只有1个拷贝正常的SMN1基因，患者则两个SMN1基因均发生了突变，无正常的SMN1基因。SMN2拷贝数越多，临床症状越轻。
[0005]目前临床上用于检测SMN1基因拷贝数的方法主要有多重连接探针扩增技术(MLPA)、变性高效液相色谱法(DHPLC)技术、限制性片段长度多态性分析聚合酶链式反应技术(PCR
‑
RFLP)、单链构象多态性聚合酶链反应(PCR
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SSCP)、荧光定量PCR技术。
[0006]其中，多重连接探针扩增技术由于SMN1与SMN2基因高度相似，该方法可准确测定出SMN1与SMN2基因的拷贝数，但操作复杂，并且需要专门的仪器，成本较高，不适于大规模测定；变性高效液相色谱法(DHPLC)技术通量大，精确度高，但同样受仪器的限制；限制性片段长度多态性分析聚合酶链式反应技术(PCR
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RFLP)、单链构象多态性聚合酶链反应(PCR
‑
SSCP)可用于SMN1基因7号外显子纯合缺失患者的定性分析，但不能检测杂合缺失型的携带者；这些方法大多比较繁杂且效果不佳，急需开发一种简便快捷、准确度高、特异性好的检测方法。
[0007]荧光定量PCR技术是由美国Applied Biosystems公司推出的一种实验技术，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行定量或定性分析。与常规PCR相比，荧光定量PCR技术具有灵敏度更高、特异性更强、自动化程度高等特点，能有效解决PCR产物的污染，在临床上广泛应用于微生物检测、病原体检测及基因分型等领域。
[0008]目前基于荧光定量PCR技术平台开发的基因多态性检测的试剂盒主要应用以下3种方法：
[0009]高分辨率溶解曲线分析技术(high resolution melting analysis，HRM)：HRM利用不同长度或不同碱基组成的DNA序列熔解曲线不同的原理，在PCR后直接运行高分辨溶解就可完成对样品多态性分析。该方法无需序列特异性探针，也不受突变碱基位点与类型的局限，操作简单，无需PCR后续操作，灵敏度高，速度快，结果准确。但该方法是基于荧光染料实现，特异性不高，且对仪器设备的要求较高，目前在临床检测试剂盒上应用较少。
[0010]Taqman探针法：是一种高度特异的荧光PCR技术，其核心是利用Taq酶的外切酶活性，水解5
’
端标记有荧光报告基团的特异探针，释放荧光信号，通过荧光定量PCR仪捕捉信号实现PCR反应的实时监控，完成基因多态性检测分析。该方法需要设计特异性的引物探针识别不同类型序列，应用荧光定量PCR仪即可完成对样品基因型的判断，操作简单，灵敏度高，特异性强，在临床检测试剂盒上广泛应用。
[0011]扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)：ARMS又名等位基因特异PCR(allele specific PCR,AS
‑
PCR)。其利用Taq DNA聚合酶缺少3'
→
5'外切酶活性，PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知碱基设计适当的引物以检测出不同基因多态性。该法在设计引物时，在引物3'端设计一错配碱基，一个与野生DNA互补，一个与突变DNA互补，使之仅能与突变型或野生型互补而只扩增突变型或野生型基因。扩增产生的PCR产物可以通过凝胶电泳或是实时荧光定量PCR(real
‑
time PCR)测定进行分析。基于荧光定量PCR技术的ARMS
‑
PCR操作简单，特异性和灵敏性高，重复性好，在临床检测试剂盒上广泛应用，是目前的主流检测技术。
[0012]由于SMN2基因与SMN1基因高度同源，仅有5个碱基的差异，SMN2基因会对SMN1基因的检测产生强烈的干扰，利用常规的荧光PCR方法可能很难区分出样本中的SMN1基因与SMN2基因，目前市面上利用荧光PCR技术检测SMN1基因时，大多都是同时对SMN1基因和SMN2基因分别设计引物和探针，这大大增加了检测成本和检测工作。
[0013]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0014]本专利技术的目的在于提供一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法以解决上述技术问题。本专利技术利用荧光定量PCR技术实现对人运动神经元存活基因1(SMN1)基因的7号外显子和8号外显子拷贝数情况进行准确测定。专利技术人采用Taqman探针法和扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)相结合的方式，仅对SMN1基因设计对应的特异引物和探针，在SMN2基因存在的样本中能准确扩增SMN1基因而几乎不扩增SMN2基因，同时对于极少数具有较多拷贝SMN2基因的样本，在检测SMN1基因时依然能准确检出，结果基本不受SMN2基因干扰，实现了在不检测SMN2基因的情况下准确检测SMN1基因。
[0015]本专利技术是这样实现的：
[0016]本专利技术提供了一种用于人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物，其包括：
[0017]用于检测SMN1基因第7外显子的第一引物探针组合物；其核苷酸序列依次为：SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物，其特征在于，其包括：用于检测SMN1基因第7外显子的第一引物探针组合物；其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；用于检测SMN1基因第8外显子的第二引物探针组合物；其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示；用于检测ICON基因的第三引物探针组合物，其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9所示。2.一种试剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的用于人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物。3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂中所述引物探针组合物的工作浓度为100
‑
300nmol/L；优选地，所述试剂中所述引物探针组合物的工作浓度为150
‑
300nmol/L；优选地，所述试剂中所述引物探针组合物的工作浓度为200nmol/L。4.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂中Mg
2+
的浓度为1
‑
5mM；优选地，所述Mg
2+
的浓度为3
‑
5mM；优选地，所述Mg
2+
的浓度为4mM；优选地，所述试剂还含有buffer，所述buffer包括：15
‑
75mM Tris、0
‑
60mM硫酸铵、0
‑
60mM氯化钾、0
‑
1mg/mL BSA、0.5
‑
1mol/L甜菜碱、0.5
‑
2％DMSO、1
‑
5％甘油和水；优选地，所述试剂还含有dNTPs和dUTP，比例为dATP：dUTP：dCTP：dGTP＝1:2:1:1；优选地，所述试剂中添加有参比染料。5.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的用于人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物或权利要求2
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：董瑞华，赵艳苹，胡博文，汪再兴，
申请(专利权)人：武汉友芝友医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：