基于使用表达增强性基因座来制备抗体的组合物和方法技术

本发明专利技术涉及重组蛋白在真核细胞中的位点特异性整合和表达。具体地讲，本发明专利技术包括通过采用表达增强性基因座来改善真核细胞尤其是中国仓鼠细胞系中的抗体的表达的组合物和方法，所述抗体包括双特异性抗体。所述抗体包括双特异性抗体。所述抗体包括双特异性抗体。

【技术实现步骤摘要】
基于使用表达增强性基因座来制备抗体的组合物和方法
[0001]本申请是CN201780024560.2的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2016年4月20日提交的美国临时申请No.62/325,385的优先权权益，其全部内容以引用方式并入本文。


[0004]本公开涉及重组蛋白在真核细胞中的位点特异性整合和表达。具体地讲，本公开涉及通过采用表达增强性基因座来改善真核细胞(尤其是中国仓鼠(Cricetulus griseus)细胞系)中的抗原结合蛋白(诸如双特异性抗体)表达的组合物和方法。

技术介绍

[0005]细胞表达系统旨在提供用于制备给定蛋白(不论用于研究或治疗用途)的可靠且高效的来源。由于例如哺乳动物表达系统对重组蛋白进行适当的翻译后修饰的能力，哺乳动物细胞中的重组蛋白表达是用于制备治疗性蛋白的优选方法。
[0006]尽管可获得许多系统，但是仍存在用于表达重组蛋白的整合基因的高效基因转移和稳定性的挑战。对于目标转基因的长期表达，一个考虑因素是对细胞基因的破坏程度最小以避免细胞系表型的变化。
[0007]对稳定细胞系进行工程化以容纳用于表达的多个基因(例如多特异性抗体中的多条抗体链)是特别具有挑战性的。可能存在整合基因表达水平的大幅变化。整合额外基因可能由于局部遗传环境(即，位置效应)而引起表达的较大变化和不稳定性。用于产生多特异性抗原结合蛋白的表达系统通常需要旨在作为特异性多聚体形式配对的两个或更多个不同免疫球蛋白链的表达，并且可通常倾向于同型二聚体的产生，而非所需的异型二聚体或多聚体组合。因此，本领域中需要经改善的哺乳动物表达系统。

技术实现思路

[0008]在一个方面，提供了含有在增强表达基因座内的特异性位点整合的外源核酸序列的细胞，其中所述外源核酸序列编码双特异性抗原结合蛋白。
[0009]在一些实施方案中，外源核酸序列包括含有编码第一轻链片段(LCF)的核苷酸序列的第一外源核酸、含有编码第一重链片段(HCF)的核苷酸序列的第二外源核酸和含有编码第二HCF(或表示为HCF*，其中第二HCF与第一HCF不同)的核苷酸序列的第三外源核酸，其中第一HCF和第二HCF以及第一LCF形成双特异性抗原结合蛋白。在某些实施方案中，第一HCF和第二HCF以及第一LCF含有双特异性抗原结合蛋白的至少两个可变区和两个CH3恒定域。在一些实施方案中，两个可变区是不同的。在一些实施方案中，两个CH3区是不同的。在一些实施方案中，每个外源核酸序列同时整合到增强表达基因座内的特异性位点。
[0010]在一些实施方案中，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一恒定区的氨基酸(例如，编码CH1、CH2、铰链或CH3结构域中的一者或多者)，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第
二恒定区的氨基酸。第一恒定区的氨基酸可以与第二恒定区的氨基酸相同或不同。在特定实施方案中，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一CH3结构域，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第二CH3结构域，其中第一CH3结构域和第二CH3结构域可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，第一CH3结构域和第二CH3结构域在至少一个氨基酸位置不同；例如，两个CH3结构域中的一个是人IgG CH3结构域，另一个是修饰的人IgG CH3结构域，并且两个CH3结构域具有不同的蛋白A结合特征。在其他实施方案中，编码第一CH3结构域和第二CH3结构域的核苷酸序列彼此不同之处在于所述核苷酸序列中的一者是经密码子修饰的。
[0011]在其他特定实施方案中，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一重链可变(VH)区，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第二VH区，其中所述第一重链和第二重链可以具有相同的或不同的VH区。在另一个实施方案中，第一VH和第二VH可以连接至相同的或不同的恒定区。
[0012]在一些实施方案中，编码第一LCF的核苷酸序列编码第一轻链可变(VL)区。
[0013]在一些实施方案中，外源核酸序列含有包括编码第二LCF的核苷酸序列的另外的外源核酸，诸如第二轻链可变(VL)区。在一些实施方案中，编码第二VL区的核苷酸序列还编码第二轻链恒定区。
[0014]基因座处的多个外源核酸的相对部分可以变化。在一些实施方案中，编码LCF的核酸相对于两种编码HCF的核酸位于上游或下游。
[0015]在一些实施方案中，编码HCF的序列或编码LCF的序列中的每一个独立地连接至转录调控序列。在特定实施方案中，第一外源核酸还包括可操作地连接至编码第一LCF的核苷酸序列的第一启动子，第二外源核酸还包括可操作地连接至编码第一HCF的核苷酸序列的第二启动子，并且第三外源核酸包括可操作地连接至编码第二HCF的核苷酸序列的第三启动子，其中第一启动子、第二启动子和第三启动子是相同的或不同的，和/或所述启动子与第四外源核酸可操作地连接到的第四启动子相同或不同。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子和第三启动子是相同的。
[0016]在一些实施方案中，整合位点处的外源核酸序列还包括重组酶识别位点，例如，相对于第一外源核酸位于5
’
的第一重组酶识别位点(RRS)，和相对于第二外源核酸和第三外源核酸位于3'的第二重组酶识别位点(RRS)，其中第一RRS和第二RRS是不同的。在一些实施方案中，第三RRS也包括在内并且相对于第一外源核酸位于3'，且相对于第二外源核酸和第三外源核酸中的一者或两者位于5
’
，其中第三RRS与第一RRS和第二RRS不同。
[0017]在一些实施方案中，外源核酸序列可包括含有选择性标记基因的第四外源核酸。在特定实施方案中，第四外源核酸相对于第一外源核酸位于3
’
。在某些实施方案中，第四外源核酸作为断裂基因而整合。在其他实施方案中，第四外源核酸或选择性标记位于第三RRS的3
′
，即可操作地连接至第四外源核酸的第四启动子的3
′
。在一些实施方案中，选择性标记基因包含第三RRS，所述第三RRS已经插入，任选地插入选择性标记基因的内含子内，其中第三RRS与第一RRS和第二RRS不同。
[0018]在某些实施方案中，基因座处的外源核酸的顺序从5'至3'可以为：第一外源核酸(编码LCF)、第四外源核酸(编码选择性标记)、第二外源核酸(编码第一HCF)和第三外源核酸(编码第二HCF)；并且在一些具体实施方案中，第二外源核酸含有编码人IgG的经修饰的CH3结构域的核苷酸序列，第三外源核酸包含编码人IgG的天然CH3结构域的核苷酸序列。
[0019]在某些实施方案中，基因座处的外源核酸的顺序从5'至3'为：第一外源核酸(编码LCF)、第二外源核酸(编码第一HCF)、第四外源核酸(编码选择性标记)和第三外源核酸(编码第二HCF)，其中第二外源核酸包含编码人IgG的天然CH3结构域的核苷酸序列，第三外源核酸包含编码人IgG的经修饰的CH3结构域。
[0020]在一些实施方案中，连接至编码HCF的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含整合到增强表达基因座内的特异性位点的外源核酸序列的细胞，其中所述外源核酸序列编码双特异性抗原结合蛋白。2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述外源核酸序列包括包含编码第一LCF的核苷酸序列的第一外源核酸、包含编码第一HCF的核苷酸序列的第二外源核酸和包含编码第二HCF的核苷酸序列的第三外源核酸。3.根据权利要求2所述的细胞，其中编码所述第一HCF的核苷酸序列编码第一CH2结构域和第一CH3结构域，并且编码所述第二HCF的核苷酸序列编码第二CH2结构域和第二CH3结构域。4.根据权利要求3所述的细胞，其中所述第一CH3结构域和所述第二CH3结构域在至少一个氨基酸位置不同。5.根据权利要求3所述的细胞，其中所述第一CH3结构域和所述第二CH3结构域是人IgG的CH3结构...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：