猪流行性腹泻病毒细菌样颗粒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及分子标记技术领域，特别涉及猪流行性腹泻病毒(PEDV)细菌样颗粒及其制备方法，本申请以广西PEDV流行株的S1基因和COE基因为靶基因，利用昆虫细胞

【技术实现步骤摘要】
猪流行性腹泻病毒细菌样颗粒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及分子标记
，特别涉及猪流行性腹泻病毒细菌样颗粒及其制备方法。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起以水样腹泻、呕吐和脱水为特征的急性、高度接触性猪肠道传染病，各年龄段猪群均可感染，其中哺乳仔猪发病率和死亡率可高达100％。自1971年首次出现在英国后，PEDV已在世界范围内广泛传播，造成了相当大的经济损失。虽然欧洲国家仅有零星疫情发生，但在亚洲，PEDV一直是猪场腹泻爆发的主要原因。
[0003]PEDV为套式病毒目、冠状病毒科、甲型冠状病毒属成员，包含纤突(S)、囊膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)4种结构蛋白，其中S蛋白是PEDV重要的结构蛋白和免疫原性抗原，携带主要的B淋巴细胞抗原表位，是研制PEDV疫苗和药物的主要靶标。S基因的缺失、插入或氨基酸的突变是PEDV突变体的主要特征，也是PED全球流行的主要原因。S1是S蛋白的主要结构域，位于病毒表面，含有PEDV重要的3个中和表位区域，在机体抗原免疫反应中起重要作用。COE是2002年发现的S1基因中的一段重要核心表位，研究证实其同样据有良好的反应原性，能够诱导机体产生中和抗体，被认为是研制PED亚单位疫苗和抗病毒药物研发的主要靶标抗原。
[0004]PEDV感染性极强，疫苗免疫是预防PEDV的重要措施之一，但近年来常有免疫猪场发生PED的报道，分析其主要原因除了目前PEDV流行株不断发生变异，现有的疫苗免疫难以对PEDV变异株提供足够的免疫保护外，也可能与现有疫苗不能诱导动物机体产生足够的粘膜免疫有关。研究表明，肠粘膜上皮细胞分泌的sIgA能有效中和侵袭部位的病毒，通过粘膜途径免疫的疫苗比其他接种方式的疫苗能更有效的诱导黏膜免疫的产生。目前，有两种策略用于提高动物黏膜免疫反应。一是利用适合的载体通过粘膜进行疫苗免疫，二是添加粘膜免疫增强剂以常规免疫途径进行免疫，粘膜免疫增强剂和粘膜给药载体的研发应用对PED传统疫苗和新型疫苗的研制具有重要意义。
[0005]PED是一种急性病毒性肠道感染疫病。传统观点认为PEDV主要通过粪口途径传播，但越来越多研究表明，空气传播也会导致PEDV暴发。现有研究发现PEDV可以通过喷鼻感染仔猪引起典型的腹泻症状，并能发展为短暂的鼻上皮感染，证实PEDV主要通过鼻粘膜感染机体。大量研究证实，与IgG抗体相比，粘膜免疫产生的sIgA抗体对通过粘膜感染的病毒具有更高的保护率。因此，针对PEDV病毒的特性，有必要开发新型疫苗，以通过粘膜免疫使粘膜部位诱导局部反应抵御病毒对呼吸道和胃肠道的感染，提高机体对病毒的抵抗力。同时，自2010年以来，致病性强的PEDV新变异株出现，在我国猪群中快速传播，于全国各地大规模流行，但现有的PEDV疫苗却不能对其提供有效的保护，因此开发针对变异流行株的PEDV新型疫苗具有重要意义。
[0006]本研究首次以PEDV广西主要流行毒株抗原基因为靶基因，将GEM
‑
PA表面展示系统
应用于PEDV疫苗研究，制备的PEDV细菌样颗粒疫苗免疫小鼠，通过体液、细胞和粘膜免疫三方面评估其免疫原性，探究PEDV细菌样颗粒疫苗的可行性，为研制PEDV新型疫苗打下基础。

技术实现思路

[0007]鉴于上述内容，有必要提供猪流行性腹泻病毒细菌样颗粒及其制备方法，该细菌样颗粒以PEDV广西主要流行毒株抗原基因为靶基因，将GEM
‑
PA表面展示系统应用于PEDV疫苗研究，制备的PEDV细菌样颗粒疫苗免疫小鼠，通过体液、细胞和粘膜免疫三方面评估其免疫原性，探究PEDV细菌样颗粒疫苗的可行性。
[0008]为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0009]猪流行性腹泻病毒细菌样颗粒，所述颗粒包括在GEM颗粒表面展示重组蛋白S1
‑
PA或COE
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PA；所述S1
‑
PA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述COE
‑
PA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]本专利技术还包括所述猪流行性腹泻病毒细菌样颗粒在制备防治由PEDV感染引起的猪流行性腹泻疫苗上的应用。
[0011]进一步的，所述疫苗通过注射、灌胃和/或滴鼻方式进行免疫。
[0012]进一步的，所述滴鼻免疫途径免疫原为表面展示COE
‑
PA蛋白的GEM颗粒，命名为COE
‑
GEM；所述滴鼻途径免疫原的COE
‑
GEM浓度为24μg。
[0013]本专利技术还包括所述猪流行性腹泻病毒细菌样颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0014](5)(1)构建融合基因及其重组表达质粒。将PEDV的S1基因或COE基因进行昆虫细胞密码子优化，同时在其5
’
端引入Kozak序列和GP67信号肽序列，然后通过连接肽linker将其分别与密码子优化的乳酸乳球菌MG1363的PA基因进行融合构建融合基因S1
‑
PA或COE
‑
PA，定向克隆于pFastBacI载体，获得重组表达质粒pFastBacI
‑
S1
‑
PA或pFastBacI
‑
COE
‑
PA；所述融合基因S1
‑
PA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；所述融合基因COE
‑
PA的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；
[0015](2)将步骤(1)获得的重组质粒pFastBacI
‑
S1
‑
PA或pFastBacI
‑
COE
‑
PA转化DH10Bac感受态细胞制备重组杆粒Bacmid
‑
S1
‑
PA或Bacmid
‑
COE
‑
PA；
[0016](3)将重组杆粒Bacmid
‑
S1
‑
PA或Bacmid
‑
COE
‑
PA分别转染Sf9细胞进行P1代重组毒的拯救，获得P1代重组杆状病毒，分别命名为Rbv
‑
S1
‑
PA、Rbv
‑
COE
‑
PA；将Rbv
‑
S1
‑
PA或Rbv
‑
COE
‑
PA按MOI＝1的接毒比例接种Sf9细胞进行重组蛋白的表达，重组蛋白经鉴定后，收集细胞裂解上清液；
[0017](4)制备GEM颗粒：将乳酸乳球菌MG1363经热酸处理后去除乳酸乳球菌核酸及自身蛋白质获得GEM颗粒；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.猪流行性腹泻病毒细菌样颗粒，其特征在于，所述颗粒包括在GEM颗粒表面展示重组蛋白S1
‑
PA或COE
‑
PA；所述S1
‑
PA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述COE
‑
PA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.如权利要求1所述猪流行性腹泻病毒细菌样颗粒在制备防治由PEDV感染引起的猪流行性腹泻疫苗上的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疫苗免疫途径为肌肉注射、灌胃和/或滴鼻。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述滴鼻免疫途径免疫原为表面展示COE
‑
PA蛋白的GEM颗粒，命名为COE
‑
GEM；所述滴鼻途径免疫原的COE
‑
GEM浓度为24μg。5.如权利要求1所述猪流行性腹泻病毒细菌样颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建融合基因及其重组表达质粒：将PEDV的S1基因或COE基因进行昆虫细胞密码子优化，在其5
’
端引入Kozak序列和GP67信号肽序列，然后通过连接肽linker将其分别与密码子优化的乳酸乳球菌PA基因进行融合构建融合基因S1
‑
PA或COE
‑
PA，定向克隆于pFastBacI载体，获得重组表达质粒pFastBacI
‑
S1
‑
PA或pFastBacI
‑
COE
‑
PA；所述融合基因S1
‑
PA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；所述融合基因COE
‑
PA的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；(2)将步骤(1)获得的重组质粒pFastBacI
‑
S1

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金凤，吴健敏，沙奕羽，覃绍敏，林俊，陈凤莲，秦树英，马玲，韦珏，许力士，韦珊珊，陆晨阳，杨磊，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：