一种异源产虫草素的米曲霉工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开一种异源产虫草素的米曲霉工程菌及其构建方法与应用，其中，构建方法包括步骤：基于蛹虫草基因组构建基因CCM

【技术实现步骤摘要】
一种异源产虫草素的米曲霉工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种异源产虫草素的米曲霉工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]丝状真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种好气性丝状真菌，归属于半知菌亚门丝孢纲曲霉属的一种常见菌种。目前米曲霉被广泛应用于食品行业方面，米曲霉作为酱油发酵及清酒酿造的使用菌种已有近千年的历史，被美国FDA和WHO认定为安全生产菌株。其次就是米曲霉具有较强产生和分泌大量蛋白的能力，与大肠杆菌和酵母相比，米曲霉具有强大的翻译后修饰功能，如糖基化、蛋白酶的切割和二硫键的形成等修饰。现如今国内外对于米曲霉的应用主要在基因调控，外源蛋白表达和次级产物开发等方面。基因组学和现代遗传改造技术的发展与应用，对米曲霉基因功能的研究，提高了米曲霉在工业上的应用潜力。
[0003]代谢工程米曲霉作为常用的工程菌株，具有生物安全、发酵周期短、适于大规模工业生产等优点，在生产有价值和复杂的天然产物方面可能比当前的异源平台更具优势。目前，在米曲霉中已经实现了多种代谢产物的异源合成，例如来自红曲霉的柠檬绿素生物合成基因簇在米曲霉中转录，首次报道引入整个基因簇在米曲霉中次生代谢产物异源产生。米曲霉可用作从细菌合成聚酮化合物的替代宿主，即使是那些需要有毒或非天然底物的细菌。目前已有研究表明虫草素生物合成必需基因CCM
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04436和CCM
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04437在酿酒酵母中表达能产生虫草素。虽然酿酒酵母中外源生物合成虫草素的含量较低，但随着虫草素的生物合成和调控机制的阐明，对蛹虫草中虫草素生物合成必需基因进行异源表达在工程菌株米曲霉中，是代谢产物异源产生的可行途径。
[0004]因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现思路

[0005]鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种异源产虫草素的米曲霉工程菌及其构建方法与应用，旨在解决现有米曲霉不能产生虫草素的问题。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种异源产虫草素的米曲霉工程菌的构建方法，其中，包括步骤：
[0008]以蛹虫草基因组中的CCM
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04436基因为模板设计第一引物，根据所述第一引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM
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04436克隆片段，所述CCM
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04436克隆片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述第一引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2
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3；
[0009]将所述CCM
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04436克隆片段与载体pEX1同源重组，得到基因CCM
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04436异源表达载体；
[0010]以蛹虫草基因组中的CCM
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04437基因为模板设计第二引物，根据所述第二引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM
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04437克隆片段，所述CCM
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04437克隆片段的核苷酸序列
为SEQ ID NO.4，所述第二引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5
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6；
[0011]将所述CCM
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04437克隆片段与载体pEX2D同源重组，得到基因CCM
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04437异源表达载体；
[0012]将所述基因CCM
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04436异源表达载体和基因CCM
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04437异源表达载体分别转化至米曲霉双缺陷型营养菌株中，构建得到异源产虫草素的米曲霉工程菌AO1和AO2，再以AO1为背景菌株转化基因CCM
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04437异源表达载体得到同时转化两个基因的转化子AO12。
[0013]一种异源产虫草素的米曲霉工程菌，其中，采用本专利技术所述异源产虫草素的米曲霉工程菌的构建方法制得。
[0014]一种异源产虫草素的米曲霉工程菌的应用，其中，将本专利技术构建方法制得的异源产虫草素的米曲霉工程菌用于生产虫草素。
[0015]有益效果：本专利技术将米曲霉菌株作为异源表达宿主工程菌株，通过将基因CCM
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04436异源表达载体和基因CCM
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04437异源表达载体分别转化至米曲霉双缺陷型营养菌株(A.oryzaeΔpyrGΔHis)中得到转化子AO1和AO2，在以AO1为背景菌株转化基因CCM
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04437异源表达载体得到同时转化两个基因的转化子AO12，在重组构建的米曲霉中实现异源合成虫草素。
附图说明
[0016]图1为本专利技术一种异源产虫草素的米曲霉工程菌的构建方法流程图。
[0017]图2为pEX1和pEX2D载体图谱，A为pEX1该双元载体携带米曲霉pyrG表达盒和由PgpdA启动子控制的GFP基因；B为pEX2D该二元载体携带米曲霉His表达盒，由PgpdA启动子控制的DsRed基因。
[0018]图3为蛹虫草CCM
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04436异源表达米曲霉载体的构建的电泳图。A：泳道1为pEX1质粒对照，泳道2、3为XhoⅠ单酶切pEX1质粒线性化片段；B：泳道1和2为蛹虫草CCM
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04436基因扩增；C：阳性单克隆验证。
[0019]图4为蛹虫草CCM
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04437异源表达米曲霉载体的构建的电泳图。A：泳道1为pEX2D质粒对照，泳道2、3为PmlⅠ单酶切pEX2D质粒线性化片段；B：泳道1和2为蛹虫草CCM
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04437基因；C：阳性单克隆验证。
[0020]图5为蛹虫草CCM
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04436/CCM
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04437异源表达到米曲霉的电泳胶图。A：泳道1，9，17为野生型对照，泳道2～8为米曲霉突变体AO1使用His F/R引物进行背景验证；10～16为米曲霉突变体AO1使用GFP F/R引物验证；18～24为米曲霉突变体AO1使用SEQ ID NO.2
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3引物验证；B：a：1～4为米曲霉突变体AO2使用引物His F/R引物进行验证；5～8为米曲霉突变体AO2使用DsRed F/R引物验证；b：1、3、5为野生型，2、4、6为米曲霉突变体AO2过表达CCM
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04437其中一株菌株，分别使用His F/R、DsRed F/R、SEQ ID NO.5
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6引物验证。
[0021]图6为蛹虫草虫草素合成基因CCM
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04436和CCM
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04437同时异源表达到米曲霉的验证电泳图。泳道1～4为米曲霉突变体AO12使用SEQ ID NO.2
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3引物验证；泳道5～8为米曲霉突变体AO12使用SEQ ID NO.5
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6引物验证。
[0022]图7为米曲霉转化子报告基因表达情况。A
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C分别是AO1、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异源产虫草素的米曲霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括步骤：以蛹虫草基因组中的CCM
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04436基因为模板设计第一引物，根据所述第一引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM
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04436克隆片段，所述CCM
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04436克隆片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述第一引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2
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3；将所述CCM
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04436克隆片段与载体pEX1同源重组，得到基因CCM
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04436异源表达载体；以蛹虫草基因组中的CCM
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04437基因为模板设计第二引物，根据所述第二引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM
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04437克隆片段，所述CCM
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04437克隆片段的核苷酸序列为...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾斌，王立，
申请(专利权)人：深圳技术大学，
类型：发明
国别省市：