一种评估致病力强度的报告体系制造技术

本发明专利技术公开了一种评估致病力强度的报告体系，通过如下步骤构建：首先构建青枯菌OE1

【技术实现步骤摘要】
一种评估致病力强度的报告体系


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种评估致病力强度的报告体系。

技术介绍

[0002]我国集约化农业发展迅速，随之而来的土传病害问题日益凸显，土壤环境和农作物安全受到巨大威胁
[1]。有研究表明，土传病原菌致病相关毒力行为受群体感应系统调控
[2]，它可控制病原菌生物膜形成、多种酶类与胞外多糖的产生以及运动性进而影响病原菌对根表的入侵与定殖。土传青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum，简称青枯菌)引起的一种毁灭性的细菌病害，严重限制经济作物的生产。研究表明，青枯菌具有两套群体感应系统：AHL系统和PhcBSR系统，其中PhcBSR群体感应系统对青枯菌代谢和毒力行为进行全局性调控，指挥各种毒性因子时序性表达和分泌，从而保障青枯菌成功入侵植物根际。该群感系统由PhcBSR合成组分和调控因子phcA构成
[3]。其中，phcB负责合成信号分子3
‑
OH PAME/MAME，phcS感知信号分子，当3
‑
OH PAME/MAME的浓度超过一定阈值，phcS便激活phcR，进而解除phcR对phcA的抑制。xpsR是受phcA直接调控的，可调节胞外多糖产生的基因
[4]，其表达量与phcA表达量呈正相关关系，且前期研究发现青枯菌胞外多糖产量与其致病力呈显著正相关关系，因此xpsR表达情况可在一定程度上评估青枯菌的致病力强弱。青枯菌致病力是影响作物生产的重要因素，了解青枯菌的致病力为寻求防控土传青枯病害的方法奠定良好的基础。如今检测青枯菌致病力的方法都十分复杂，缺乏简便直观的青枯菌致病力检测方法。

技术实现思路

[0003]针对现有技术的不足，本专利技术目的在于提供一种评估致病力强度的报告体系，直观的评估青枯菌群体感应系统表达情况以及青枯菌的致病力强弱。申请人研究发现，PhcBSR群体感应系统可对青枯菌毒力行为进行全局性调控，通过观察3
‑
OH PAME/MAME对群体感应系统表达的影响可直观的了解青枯菌致病力强弱。
[0004]一种评估致病力强度的报告体系，通过如下步骤构建：首先利用青枯菌自身修复能力构建青枯菌OE1
‑
1的ΔphcB突变体(OE1
‑1‑
dphcB)，将phcA的直接转录靶点xpsR(同时也是胞外多糖基因表达的启动子)的启动子区域与编码β
‑
半乳糖苷酶的大肠杆菌报告基因lacZ分别连接到pUC18
‑
mini
‑
Tn7T
‑
Gm质粒上，通过电激转入OE1
‑1‑
dphcB后，利用PCR反应筛选构建成功的菌株，即为报告菌株。
[0005]将报告菌株与待测菌株共培养进行β
‑
半乳糖苷酶活实验，检测xpsR表达情况；xpsR表达情况与lacZ表达呈正相关关系，待测青枯菌株致病力越强，则β
‑
半乳糖苷酶活性越强，生化实验反应液显色越明显。
[0006]在具体的实施方案中，所述评估致病力强度的报告体系通过如下步骤构建：
[0007]步骤1，青枯菌OE1
‑
1的ΔphcB突变体构建：PCR反应扩增出phcB左右各500bp的序列并融合，连接至PBLUESCRIPT II KS+质粒载体上，通过HindIII和BamHI双酶切获得所需
片段后连接至pK18
‑
Km质粒载体，得到连接正确的载体后转入E.coliS17
‑
1菌株中，通过接合转移的方式将连接正确的pK18
‑
Km质粒转入青枯菌中，筛选出ΔphcB突变株；
[0008]步骤2，pUC18
‑
Tn7
‑
xpsR
‑
lacZ
‑
Gm质粒的构建：PCR反应扩增出phcA的直接转录靶点xpsR的启动子区域并连接至PBLUESCRIPT II KS+质粒载体上，通过HindIII和BamHI双酶切获得所需片段后连接至pUC18
‑
mini
‑
Tn7T
‑
Gm质粒载体，随后对该载体和含有编码β
‑
半乳糖苷酶的报告基因lacZ的质粒lacZYA分别进行KpnI单酶切，将lacZYA酶切产物与KpnI单酶切的pUC18
‑
mini
‑
Tn7T
‑
Gm质粒载体相连，构建pUC18
‑
Tn7
‑
xpsR
‑
lacZ
‑
Gm质粒；
[0009]步骤3，xpsR
‑
lacZ报告体系的构建：利用构建成功pUC18
‑
Tn7
‑
xpsR
‑
lacZ
‑
Gm质粒，通过含有转座酶pTNS2辅助质粒，利用电激法，将目的片段xpsR
‑
lacZ定点插入在步骤1的ΔphcB突变株的glmS基因下游的attTn7位点，利用含有25μg/mL庆大霉素的BG培养基筛选OE1
‑1‑
dphcB
‑
xpsR
‑
lacZ菌株。
[0010]通过将报告菌株与待测青枯菌共培养，进行β
‑
半乳糖苷酶活实验来直观的了解待测青枯菌群体感应表达情况以及病原菌致病力强弱。
[0011]在具体的实施方案中，报告体系所用土传植物致病菌株为OE1
‑
1，分类命名为茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。
[0012]在具体的实施方案中，所述步骤1中，phcB基因的左侧臂引物如下：phcB
‑
A
‑
F：CGATGACCATGACGTCAGAG；
[0013]phcB
‑
A
‑
R：CGATCATGGTGCGTGCGCTCGGTGCGAATTTGCCGGAGAC。
[0014]在具体的实施方案中，所述步骤1中，phcB基因的右侧臂引物如下：phcB
‑
B
‑
F：GTCTCCGGCAAATTCGCACCGAGCGCACGCACCATGATCG；
[0015]phcB
‑
B
‑
R：TGAACAGCGAGTGCACGATG。
[0016]在具体的实施方案中，所述步骤2中，xpsR基因引物如下：
[0017]xpsR
‑
F：CGCGAGGTACCGGGCCCAAG；
[0018]xpsR
‑
R：TTCGGTAATTTCCCTCCGGA。
[0019]在具体的实施方案中，BG固体培养基为：B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种评估致病力强度的报告体系，通过如下步骤构建：首先构建青枯菌OE1
‑
1的ΔphcB突变体OE1
‑1‑
dphcB，接着将phcA的直接转录靶点xpsR的启动子区域与编码β
‑
半乳糖苷酶的大肠杆菌报告基因lacZ分别连接到pUC18
‑
mini
‑
Tn7T
‑
Gm质粒上，通过电激转入OE1
‑1‑
dphcB后，利用PCR反应筛选构建成功的菌株，即为报告菌株。2.根据权利要求1所述的一种评估致病力强度的报告体系，其特征在于，通过如下步骤构建：步骤1，青枯菌OE1
‑
1的ΔphcB突变体构建：PCR反应扩增出phcB左右各500bp的序列并融合，连接至PBLUESCRIPT II KS+质粒载体上，通过HindIII和BamHI双酶切获得所需片段后连接至pK18
‑
Km质粒载体，得到连接正确的载体后转入E.coli S17
‑
1菌株中，通过接合转移的方式将连接正确的pK18
‑
Km质粒转入青枯菌中，筛选出ΔphcB突变株；步骤2，pUC18
‑
Tn7
‑
xpsR
‑
lacZ
‑
Gm质粒的构建：PCR反应扩增出phcA的直接转录靶点xpsR的启动子区域并连接至PBLUESCRIPT II KS+质粒载体上，通过HindIII和BamHI双酶切获得所需片段后连接至pUC18
‑
mini
‑
Tn7T
‑
Gm质粒载体，随后对该载体和含有编码β
‑
半乳糖苷酶的报告基因lacZ的质粒lacZYA分别进行KpnI单酶切，将lacZYA酶切产物与KpnI单酶切的pUC18
‑
mini
‑
Tn7T
‑
Gm质粒载体相连，构建pUC18
‑
Tn7
‑
xpsR
‑
lacZ
‑
Gm质粒；步骤3，xpsR
‑
lacZ报告体系的构建：利用构建成功pUC18
‑
Tn7
‑
xpsR
‑
lacZ
‑
Gm质粒，通过含有转座酶pTNS2辅助...

【专利技术属性】
技术研发人员：江高飞，韦中，张艺，徐阳春，沈其荣，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：