剪接因子SF3B4在制备肾透明细胞癌诊断及预后评估试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术提供剪接因子SF3B4在制备用于肾透明细胞癌的诊断、预测或预后的试剂中的用途。提供一种检测SF3B4的试剂盒，其特征在于含有检测SF3B4的试剂，所述试剂包括特异性引物和特异性抗体。提供一种采用实时定量PCR方法检测SF3B4基因的mRNA在肾透明细胞癌组织或正常组织中的表达，判断肾透明细胞癌样本的方法。还提供一种采用Westernblot检测SF3B4蛋白质在肾透明细胞癌患者肿瘤组织或正常肾组织中的表达量的方法。还提供一种采用免疫组化技术检测SF3B4蛋白质在肾透明细胞癌患者肿瘤组织或正常肾组织中的表达量，判断肾透明细胞癌患者预后的方法。者预后的方法。者预后的方法。

【技术实现步骤摘要】
Cell Carcinoma.Anticancer Res 2020；40(5):2941
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2946.]和卵巢癌(OC)[Diao Y,Li Y,Wang Z,Wang S,Li P,Kong B.SF3B4 promot es ovarian cancer progression by regulating alternative splicing of RAD52.Cell Death Dis2022；13(2):179.]的肿瘤发生，而其下调或耗竭导致胰腺癌[Zhou W,Ma N,Jiang H,Ron g Y,Deng Y,Feng Y,et al.SF3B4 is decreased in pancreatic cancer and inhibits the grow th and migration of cancer cells.Tumour Biol 2017；39(3):1010428317695913.]和NS患者的乳腺癌[Denu RA,Burkard ME.Synchronous Bilateral Breast Cancer in a Patient With Nager Syndrome.Clin Breast Cancer 2017；17(3):e151
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e153.]。这些发现表明SF3B4在不同环境和不同癌细胞中发挥不同的功能作用，强烈表明SF3B4在细胞生长中的重要作用以及精细调节的SF3B4水平对调节肿瘤细胞稳定的重要性。然而目前尚无SF3B4在肾透明细胞癌中相关的研究报道，SF3B4在肾透明细胞癌发生发展中的分子机制仍不清楚。并且目前还未见剪接因子SF3B4在制备肾透明细胞癌诊断或预测肾透明细胞癌患者预后的应用的研究报道。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的不足，本专利技术的目的，一方面在于寻找可有效用于肾透明细胞癌诊断、治疗方案选择、肾透明细胞癌预后评估的标志基因；另一方面，利用SF3B4在肾透明细胞癌中高表达并促进肿瘤细胞的增殖及迁移，提供SF3B4作为肾透明细胞癌的治疗靶点及诊断标志物在临床检测试剂盒中的应用。
[0005]本专利技术提供剪接因子SF3B4在制备用于肾透明细胞癌的诊断、预测或预后的试剂中的用途。
[0006]本专利技术提供一种检测SF3B4的试剂，用于诊断肾透明细胞癌的进展或评价肾透明细胞癌恶化程度和预计后的基因标志物，并用于在制备试剂盒。
[0007]本专利技术提供一种检测SF3B4的试剂盒，其中含有检测SF3B4的试剂，所述试剂包括特异性引物和特异性抗体等。
[0008]其中，所述特异性引物包括：SF3B4
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forward：GGGAAGCCAATACGGGTGAA；SF3B4
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reward:AAGCCCAGACCCCAATGATG；内参引物GAPDH
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forward：AATGGGCAGCCGTTA GGAAA；GAPDH
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reward：GCGCCCAATACGACCAAATC。
[0009]在本专利技术中，SF3B4基因在肾透明细胞癌组织中水平显著高于癌旁或正常组织，SF3B4基因的表达水平与肾透明细胞癌grade、stage、N stage及M stage分级呈正相关关系。
[0010]本专利技术提供一种采用实时定量PCR方法检测SF3B4基因的mRNA在肾透明细胞癌组织及相应的正常组织中的表达，，判断肾透明细胞癌样本的方法。
[0011]其中，所述方法包括(1)取肾组织，并提取它们的RNA；(2)对这些组织RNA进行逆转录，得到组织的cDNA；(3)以上述cDNA为模板，及上述引物进行实时量PCR反应，测定SF3B4基因的表达。
[0012]上述方法中，实时量PCR反应的条件为：55℃1分钟，95℃2分钟，1个循环；95℃15秒，55℃30秒，72℃30秒，40个循环。
[0013]上述方法中，肾组织SF3B4基因在PCR反应的结果利用2
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ddCt
进行分析，组织中SF3B4
的mRNA表达与正常肾组织中SF3B4基因mRNA表达量进行对比，当样本中SF3B4基因的mRNA表达量高于正常组织中SF3B4的mRNA表达量时，该样本为肾透明细胞癌样本。
[0014]本专利技术提供一种判断肾透明细胞癌样本的方法，含有如下步骤：
[0015]总RNA的提取(利用Total mRNA Extract kit(Omiga)提取及参照操作手册进行)
[0016]将50mg的
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80℃保存的肾癌及相应的癌旁组织加入1mL裂解液，使用研磨器充裂解组织，向组织裂解液中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s后，冰上静置10分钟，待溶液出现明显的分层后，放入4℃离心机12,000g离心15min，这时溶液便分为三层，使用移液枪小心转移上层水相到一个新的无RNA酶EP管中，并加入1/3倍体积的无水乙醇，用枪充分吹打混匀，将混合液体转移到HiBind RNA离心柱中，室温10,000g离心1min，将流出液弃掉，将离心柱放置于新的收集管中，并加入300μL的RNA洗杂缓冲液Ⅰ，10,000g离心1min，将流出液弃掉，在离心柱中再次加入400μL RNA洗杂缓冲液Ⅰ，10,000g离心1min，将流出液弃掉，在离心柱中加入500μL用无水乙醇稀释的RNA洗杂缓冲液Ⅱ，10,000g离心1min，将流出液弃掉，再次在离心柱中加入500μL用无水乙醇稀释的RNA洗杂缓冲液Ⅱ，10,000g离心1min，将流出液弃掉，将离心柱放置在空的收集管中，13,000g离心2min，将残余液体充分除去，将离心柱置于新的1.5mL无RNA酶离心管中，在离心柱中加入50μL DEPC水，室温静置2min，13,000g离心1min，重新将离心出的液体吸回离心柱中，重复离心一次，最后收集的洗脱液即为提取的RNA，放置在
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80℃保存，取2μL提取的RNA溶液，进行1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察RNA完整性，28S、18S条带完整、清晰，5S条带几乎看不见，并且28S亮度是18S的2倍，表明RNA提取完整没有降解，使用核酸定量仪对所提取的RNA进行检测，可以得到RNA浓度和总量，并且OD260/280比值在1.8～2.0范围内，表明所得的RNA纯度比较高，可以进行后续实验，
[0017]按照ThermoFisher逆转录试剂盒使用说明将反应体系混合，各组分配制如下：
[0018]组分剂量总RNA5μg随机引物1μL无核酸酶水补至12μL
[0019]将上述反应体系放到PCR仪中，65℃，5min后，立即从PCR仪中拿出放置冰上，再加入以下试剂：
[0020]组分剂量5x反应缓冲液4μLdNTP混合2μLRiboLock RNase抑制剂1μLRevertAid逆转录酶1μL总体积20μL
[0021]将上述反应体系放到PCR仪中，按照如下条件进行逆转录本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.剪接因子SF3B4在制备用于肾透明细胞癌的诊断、预测或预后的试剂中的用途。2.一种检测SF3B4的试剂盒，其特征在于含有检测SF3B4的试剂，所述试剂包括特异性引物和特异性抗体，所述特异性引物包括：SF3B4
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forward：GGGAAGCCAATACGGGTGAA；SF3B4
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reward:AAGCCCAGACCCCAATGATG；内参引物GAPDH
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forward：AATGGGCAGCCGTTAGGAAA；GAPDH
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reward：GCGCCCAATACGACCAAATC。3.一种采用实时定量PCR方法检测SF3B4基因的mRNA在肾透明细胞癌组织或正常组织中的表达，判断肾透明细胞癌样本的方法，所述方法包括(1)取肾组织，并提取它们的RNA；(2)对这些组织RNA进行逆转录，得到组织的cDNA；(3)以上述cDNA为模板，及上述引物进行实时量PCR反应，测定SF3B4基因的表达；所述方法中，实时量PCR反应的条件为：55℃1分钟，95℃2分钟，1个循环；95℃15秒，55℃30秒，72℃30秒，40个循环；所述方法中，肾组织SF3B4基因在PCR反应的结果利用2
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ddCt
进行分析，组织中SF3B4的mRNA表达与正常肾组织中SF3B4基因mRNA表达量进行对比，当样本中SF3B4基因的mRNA表达量高于正常组织中SF3B4的mRNA表达量时，该样本为肾透明细胞癌样本。4.本发明提供一种判断肾透明细胞癌样本的方法，含有如下步骤：总RNA的提取，利用Total mRNA Extract kit(Omiga)提取及参照操作手册进行；将50mg的
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80℃保存的肾癌及相应的癌旁组织加入1mL裂解液，使用研磨器充裂解组织，向组织裂解液中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s后，冰上静置10分钟，待溶液出现明显的分层后，放入4℃离心机12,000g离心15min，这时溶液便分为三层，使用移液枪小心转移上层水相到一个新的无RNA酶EP管中，并加入1/3倍体积的无水乙醇，用枪充分吹打混匀，将混合液体转移到HiBind RNA离心柱中，室温10,000g离心1min，将流出液弃掉，将离心柱放置于新的收集管中，并加入300μL的RNA洗杂缓冲液Ⅰ，10,000g离心1min，将流出液弃掉，在离心柱中再次加入400μL RNA洗杂缓冲液Ⅰ，10,000g离心1min，将流出液弃掉，在离心柱中加入500μL用无水乙醇稀释的RNA洗杂缓冲液Ⅱ，10,000g离心1min，将流出液弃掉，再次在离心柱中加入500μL用无水乙醇稀释的RNA洗杂缓冲液Ⅱ，10,000g离心1min，将流出液弃掉，将离心柱放置在空的收集管中，13,000g离心2min，将残余液体充分除去，将离心柱置于新的1.5mL无RNA酶离心管中，在离心柱中加入50μLDEPC水，室温静置2min，13,000g离心1min，重新将离心出的液体吸回离心柱中，重复离心一次，最后收集的洗脱液即为提取的RNA，放置在
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80℃保存，取2μL提取的RNA溶液，进行1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察RNA完整性，28S、18S条带完整、清晰，5S条带几乎看不见，并且28S亮度是18S的2倍，表明RNA提取完整没有降解，使用核酸定量仪对所提取的RNA进行检测，可以得到RNA浓度和总量，并且OD260/280比值在1.8～2.0范围内，表明所得的RNA纯度比较高，可以进行后续实验；按照ThermoFisher逆转录试剂盒使用说明将反应体系混合，各组分配制如下：将上述反应体系放到PCR仪中，65℃，5min后，立即从PCR仪中拿出放置冰上，再加入以下试剂：
将上述反应体系放到PCR仪中，按照如下条件进行逆转录反应：实时定量荧光PCR(Real
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time quantitative PCR)将上一步反转录所得的cDNA(即由总RNA中mRNA反转录所得到的)按照1:5稀释，并按照如下比例配制反应的体系：离心混匀后，按照以下反应条件，进行实时定量PCR反应：相对定量法采用比较Ct法，GAPDH作为内参，采用ΔΔCt(Ct目的
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Ct内参)法进行相对定量分析，用2
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ΔΔCt
计算所得值作为目的RNA的相对表达量，结果如图1所示，可见肾癌组织
中SF3B4的mRNA表达相对较高，相应的癌旁组织中SF3B4的mRNA表达相对低，说明SF3B4的mRNA表达可以在肿瘤组织中表达上升。5.一种采用Western blot检测SF3B4蛋白质在肾透明细胞癌患者肿瘤组织或正常肾组织中的表达量的方法，其特征在于所述方法需要使用试剂盒，所述试剂盒是将SF3B4蛋白作为分子标记，包含有SF3B4特异抗体(abcam,ab157117)、SDS
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PAGE、电泳缓冲液、蛋白质Marker、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)，脱脂奶粉，HRP标记的二抗(1:10000,Ro ckland)、膜用Immobilon
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Western化学发光液。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于使用所述试剂盒，并将肾组织SF3B4蛋白质在Western blot的结果利用灰度值扫描进行分析，肿瘤组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿长宝，杨展，聂子元，张宏，
申请(专利权)人：河北医科大学第二医院，
类型：发明
国别省市：