一种多重荧光免疫组化检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于用于癌症检测的免疫测定技术领域，涉及一种多重荧光免疫组化检测试剂盒及其应用。针对现有技术多重荧光免疫组化检测中，对同一张切片上的多种不同抗原同时标记时，干扰多，灵敏度低，批次间稳定性差技术问题，本申请提供一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，可对同一张组织切片上的多至8种不同抗原进行不同的荧光标记，同时结合不同平台的全光谱荧光成像系统以及光谱拆分成像软件，均可对多至9色(含细胞核)的组织切片进行成像。本申请还提供了一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，适用于多种癌症，可采用自动化染色仪器操作，批次间稳定性更强，更节约人力成本，对科研及临床帮助更大。科研及临床帮助更大。科研及临床帮助更大。

【技术实现步骤摘要】
一种多重荧光免疫组化检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于用于癌症检测的免疫测定
，具体地，涉及一种多重荧光免疫组化检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]免疫组织化学(IHC)是利用抗体特异性识别对应抗原的特性，通过酶标抗体识别抗原，并催化底物显色，最终将抗原在组织上特异性的标记出来的技术。该技术作为基础的免疫学技术之一，一直在生命科学领域被广泛使用。尤其是在医疗诊断方面，临床病理诊断，尤其是肿瘤等疾病的诊断，IHC方法因其可直接在组织上原位标记，且方法经典，操作简便，结果灵敏可靠，成为金标准，发挥着重要作用。但随着疾病的个性化诊疗需求的增加，尤其是近年来，肿瘤领域中靶向药物越来越多的应用于临床，诊断指标以及药物临床入组需筛选指标越来越多，而单张样本切片只能检测一个指标的IHC技术愈发显示出其局限性，如无法显示不同指标共定位、在多指标检测时需较多切片、不同切片存在组织异质性等。在IHC方法的基础上，采用枝杈TSA染料取代传统IHC中的DAB染料，通过多轮次染色，可对同一张组织切片上的多种不同抗原进行不同的荧光标记。
[0003]如中国专利申请公布号CN111830256A，专利技术名称为“一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒及使用方法”，公开的试剂盒包括试剂A、试剂B、稀释液、FITC试剂、Cy3试剂及Cy5试剂，该试剂盒采用TSA信号放大技术，其原理与普通的免疫组化类似，一抗与抗原结合后，孵育HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定地共价结合荧光素，之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换第二种一抗进行第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记，并且每轮只孵育一种抗体，微波处理后洗去非共价结合的抗体，所以对所用抗体种属来源无限制。但是，该方案需采用分步染色，先催化Biotin
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Tyramide链接上去，再用Strepavidin
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染料，操作复杂，耗时长，不利于临床使用。
[0004]中国专利申请公布号CN109541217A，专利技术名称为“一种霍奇金淋巴瘤的多重免疫组化分析试剂盒及其使用方法和应用”，公开的试剂盒限定了单克隆抗体组包括CD3单克隆抗体、CD30单克隆抗体、CD68单克隆抗体、CD56单克隆抗体、LAG3单克隆抗体、PD1单克隆抗体和PDL1单克隆抗体中的两种以上、不超过六种。该方案仅能标记不超过六种免疫检查点，且仅适用于霍奇金淋巴瘤。现有技术中亟需一种适用于多种癌症，且精确度高的多重荧光免疫组化检测试剂盒。

技术实现思路

[0005]1、要解决的问题
[0006]针对现有技术多重荧光免疫组化检测中，对同一张切片上的多种不同抗原同时标记时，干扰多，灵敏度低，批次间稳定性差技术问题，本申请提供一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，可对同一张组织切片上的多至8种不同抗原进行不同的荧光标记，同时结合全光
谱荧光成像系统以及光谱拆分成像软件，对多至9色(含细胞核)的组织切片进行成像。本申请还提供了一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，适用于多种癌症，可采用自动化染色仪器操作，批次间稳定性更强，更节约人力成本，对科研及临床帮助更大。
[0007]2、技术方案
[0008]为达到上述目的，提供的技术方案为：
[0009]本专利技术的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：抗原染液、细胞核染液、信号放大稀释液、HRP酶标二抗聚合物、抗荧光淬灭封片剂、缓冲液；
[0010]所述抗原染液包括TSA480、TSA520、TSA540、TSA570、TSA620、TSA650、TSA700、TSA770。
[0011]进一步的，所述HRP酶标二抗聚合物为鼠兔通用聚合物HRP酶标二抗。
[0012]进一步的，所述细胞核染液为DAPI染液；所述缓冲液为TBST缓冲液。
[0013]优选的，所述信号放大稀释液为0.3％H2O2，抗荧光淬灭封片剂为可选普通商用抗荧光淬灭封片剂。
[0014]进一步的，还包括二甲苯溶液、乙醇溶液和中性福尔马林溶液。
[0015]优选的，还包括抗原修复液，所述抗原修复液为pH值为6.0的0.01M柠檬酸钠修复液或pH值为9的Tris
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EDTA溶液(0.05M Tris，0.001M EDTA)。
[0016]进一步的，所述乙醇溶液包含3个浓度梯度，质量分数分别为70％、95％和100％；所述中性福尔马林溶液的质量分数为10％。
[0017]一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，使用所述多重荧光免疫组化检测试剂盒；将所述多重荧光免疫组化检测试剂盒应用于癌症的检测中。
[0018]优选的，所述癌症为肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、黑色素瘤等。
[0019]进一步的，包括如下步骤：脱蜡水合；微波抗原修复；封闭；一抗孵育；二抗孵育；用所述抗原染液荧光染色；重复一抗孵育、二抗孵育和荧光染色，重复次数≤7次；细胞核染色；封片。
[0020]优选的，所述微波抗原修复步骤中，将脱蜡水合后的载玻片置于修复杯中，用抗原修复液浸没，将修复杯置于微波炉内高火煮沸，低火维持15min，注意补液，防止蒸发过度导致干片，取出室温自然冷却至室温。
[0021]优选的，所述封闭步骤中，去除载玻片上残存洗液，用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿，震荡10min。
[0022]进一步的，所述一抗孵育步骤中，用缓冲液浸洗载玻片，重复1次；所述二抗孵育步骤中，滴加所述HRP酶标二抗聚合物孵育，用缓冲液浸洗载玻片，重复1次；所述荧光染色步骤中，滴加所述抗原染液孵育，用缓冲液浸洗载玻片，重复3次，微波修复，灭菌水洗片1次，缓冲液浸片后封闭。
[0023]优选的，所述一抗孵育步骤中，去除载玻片上的封闭，用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域，室温保湿震荡孵育1h，需针对不同抗体做优化调整，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为3min。
[0024]优选的，所述二抗孵育步骤中，去除载玻片上残存的洗液，直接滴加HRP酶标二抗聚合物，浸没样本区域，室温保湿孵育10min，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为3min。
[0025]优选的，所述荧光染色步骤中，去除载玻片上残存的洗液，用移液器在载玻片上滴
加抗原染液浸没样本区域，室温保湿震荡孵育10min，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为3min，微波修复，室温自然冷却至室温，灭菌水洗载玻片1次，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为2min，单染结束，封片观察或追加后续染色，从步骤3封闭开始后续染色，每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用缓冲液覆盖样品，防止干片。
[0026]进一步的，所述细胞核染色步骤中，滴加所述细胞核染液孵育，用缓冲液浸洗载玻片，重复3次。
[0027]优选的，所述细胞核染色步骤中，室温孵育5min，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为2m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下组分：抗原染液、细胞核染液、信号放大稀释液、HRP酶标二抗聚合物、抗荧光淬灭封片剂、缓冲液；所述抗原染液包括TSA480、TSA520、TSA540、TSA570、TSA620、TSA650、TSA700、TSA770。2.根据权利要求1所述的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，其特征在于：所述HRP酶标二抗聚合物为鼠兔通用聚合物HRP酶标二抗。3.根据权利要求1所述的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，其特征在于：所述细胞核染液为DAPI染液；所述缓冲液为TBST缓冲液。4.根据权利要求1
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3任一项所述的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，其特征在于：还包括二甲苯溶液、乙醇溶液和中性福尔马林溶液。5.根据权利要求4所述的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，其特征在于：所述乙醇溶液包含3个浓度梯度，质量分数分别为70％、95％和100％；所述中性福尔马林溶液的质量分数为10％。6.一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，其特征在于：使用权利要求1
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5任一项所述多重荧光免疫组化检测试剂盒；将所述多重荧光免疫组化检测试剂盒应用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：董浩，钱辰颖，王妤婷，朱迪，郭惠芳，
申请(专利权)人：爱必信上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：