基于Spacer基因定向插入TC-Tag标签的细胞系、重组病毒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种基于Spacer基因定向插入TC

【技术实现步骤摘要】
hepatitis B virus vector efficiently suppresses wild
‑
type virus infection.Proc Natl Acad Sci USA.1999.96,10818
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10823.Wang Z,Wu L,Cheng X,et al.Replication competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation.PLoS One.2013.8,e60306.)。此外，由于存在大量不包含HBV基因组的亚病毒粒子(SVP)，HBV病毒粒子的纯化具有挑战性。虽然已有文献报道了试图使用多种方法来荧光标记HBV及其SVPs(Sun S,Yan J,Xia C,et al..Visualizing hepatitis B virus with biarsenical labelling in living cells.Liver International.2014.34,1532
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1542.Hao X,Shang X,Wu J,et al..Single
‑
particle tracking of hepatitis B virus
‑
like vesicle entry into cells.Small.2011.7,1212
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1218.Wu J,Hao X,Wang Z,et al.Tracking hepatitis Bvirus
‑
like vesicles in living cells.Chem Rapid Commu.2013.1,27
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30.Lambert C,Thome N,Kluck CJ et al.Functional incorporation of green fluorescent protein into hepatitis B virus envelope particles.Virology.2004.330,158
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167.Paula EF,Raumona NG,Catalin L,Simona R,et al.Labeling of hepatitis B virus middle envelope protein with enhanced green fluorescent protein.Rom Biotechnology Lett.2014.19,9974
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9983.)，但是重组乙肝病毒是否具有复制感染能力均未被证实，不能真实反应HBV的整个生活周期，并且在活细胞中实现病毒感染过程的实时追踪在技术上仍然存在挑战性，需要进一步探究和优化更多的标记策略。因此，有必要开发一种具有复制感染能力新型重组病毒报告系统，用于实现活细胞内对病毒感染过程可视化的探究。

技术实现思路

[0004]为了解决所述技术问题，本专利技术提供了一种基于Spacer基因定向插入TC
‑
Tag标签的细胞系、重组病毒及其制备方法与应用，基于NanoBiT荧光互补的报告系统，将TC编码序列定向插入到D型HBV1.3基因组中，特异性与LgBiT大亚基结合，在底物的作用下发出稳定的荧光信号，成功构建了重组病毒报告系统。该构建策略可以获得新型重组病毒(HBV
‑
TC)，并且在一定程度上并不影响病毒的复制感染能力。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]在本专利技术的第一方面，提供了一种基于Spacer基因定向插入TC
‑
Tag标签的细胞系的制备方法，所述方法包括：
[0007]将载体pCDN3.1
‑
CMV
‑
G418通过SacI/PmeI双酶切，获得线性化载体骨架片段；
[0008]将SEQ ID NO.4
‑
SEQ ID NO.5所示引物和SEQ ID NO.6
‑
SEQ ID NO.7所示引物对D型HBV1.3倍体质粒进行扩增，分别获得片段1和片段2；
[0009]将所述线性化载体骨架片段、片段1和片段2通过同源重组和转化，获得重组质粒pCDN3.1
‑
CMV
‑
HBV1.3
‑
TC
‑
G418；
[0010]将所述重组质粒pCDN3.1
‑
HBV1.3
‑
TC
‑
G418经ScaI单酶切获得线性化片段，后转染HepG2细胞并通过G418抗性筛选，获得多克隆细胞系；将所述多克隆细胞系通过G418抗性筛选，获得基于Spacer基因定向插入TC
‑
Tag标签的细胞系。
[0011]所述载体pCDN3.1
‑
CMV
‑
G418质粒序列如SEQ ID NO.2所示；
[0012]所述HBV1.3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0013]所述重组质粒pCDN3.1
‑
CMV
‑
HBV1.3
‑
TC
‑
G418的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014]在本专利技术的第二方面，提供了采用所述的方法制备得到的基于Spacer基因定向插入TC
‑
Tag标签的细胞系。
[0015]在本专利技术的第三方面，提供了基于Spacer基因定向插入TC
‑
Tag标签的重组病毒的制备方法，所述方法包括：
[0016]将所述的基于Spacer基因定向插入TC
‑
Tag标签的细胞系扩大培养至细胞密度达到70％
‑
90％时更换为含有DMSO的培养基进行诱导，收集细胞培养上清，并更换为新鲜的产毒培养基；
[0017]将所述细胞培养上清通过离心和过滤，获得浓缩病毒液，即基于Spacer基因定向插入TC
‑
Tag标签的重组病毒。
[0018]进一步地，所述含有DMSO的培养基中DMSO的添加体积为培养基体积的2％
±
0.5％。
[0019]在本专利技术的第四方面，提供了采用所述的方法制备得到的基于Spacer基因定向插入TC
‑
Tag标签的重组病毒。
[0020]在本专利技术的第五方面，提供了所述的基于Spacer基因定向插入TC
‑
Tag标签的细胞系在筛选和评估新型抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
[0021]在本专利技术的第六方面，提供了所述的基于Spacer基因定向插入TC
‑
Tag标签的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Spacer基因定向插入TC
‑
Tag标签的细胞系的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将载体pCDN3.1
‑
CMV
‑
G418通过SacI/PmeI双酶切，获得线性化载体骨架片段；将SEQ ID NO.4
‑
SEQ ID NO.5所示引物和SEQ ID NO.6
‑
SEQ ID NO.7所示引物对D型HBV1.3倍体质粒进行扩增，分别获得片段1和片段2；将所述线性化载体骨架片段、片段1和片段2通过同源重组和转化，获得重组质粒pCDN3.1
‑
CMV
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HBV1.3
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TC
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G418；将所述重组质粒pCDN3.1
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HBV1.3
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TC
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G418经ScaI单酶切获得线性化片段，后转染HepG2细胞并通过G418抗性筛选，获得多克隆细胞系；将所述多克隆细胞系通过G418抗性筛选，获得基于Spacer基因定向插入TC
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Tag标签的细胞系。2.一种采用权利要求1所述的方法制备得到的基于Spa...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏宇尘，赵莉，程晓明，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：