用于产生AAV的双双功能载体制造技术

本发明专利技术涉及用于产生重组细小病毒基因治疗载体的核酸构建体的新组合。特别地，本发明专利技术涉及一种优选不超过两种构建体的组合，第一构建体表达细小病毒Cap和Rep蛋白两者，而第二构建体至少包含侧翼为ITR的转基因并且任选地再次包含Cap蛋白的表达盒。所述核酸构建体优选是用于在昆虫细胞中产生rAAV的杆状病毒载体。是用于在昆虫细胞中产生rAAV的杆状病毒载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生AAV的双双功能载体


[0001]本专利技术涉及医学、分子生物学和基因治疗领域。本专利技术涉及在细胞中产生蛋白质，其中在杆状病毒载体中使用重复的不完全回文/同源重复序列。特别地，本专利技术涉及可用于基因治疗的细小病毒载体的生产，并且涉及提高细小病毒载体生产率的病毒复制酶(Rep)蛋白的表达的改进。

技术介绍

[0002]杆状病毒表达系统作为真核克隆和表达载体的用途是众所周知的(King,L.A.,and R.D.Possee,1992,“The baculovirus expression system”,Chapman and Hall,United Kingdom；O
’
Reilly,D.R.,et al.,1992.Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual.New York:W.H.Freeman)。所述杆状病毒表达系统的优点尤其在于，所表达的蛋白几乎总是可溶的、正确折叠的和生物活性的。另外的优点包括蛋白质表达水平高，生产速度更快，适合于大蛋白质的表达和适合于大规模生产。然而，在昆虫细胞生物反应器中使用杆状病毒系统大规模或连续生产异源蛋白时，生产水平的不稳定性是一个主要障碍。这种效应至少部分是由于杆状病毒DNA中重复同源序列之间的重组。
[0003]杆状病毒表达系统还成功地用于生产重组腺相关病毒(rAAV)载体(Urabe et al.,2002,Hum.Gene Ther.13:1935
–
1943；US 6,723,551和US 20040197895)。AAV可被认为是人类基因治疗最有前景的病毒载体之一。迄今为止，两个平台已经成为能够递送研究和临床级AAV材料的主要生产系统。在这两种情况下，将包含复制酶(Rep，DNA复制和包装蛋白)和衣壳(Cap，结构蛋白)编码基因的表达盒与侧翼为AAV2反向末端重复序列(ITR)的待包装转基因一起递送至生产细胞。一种方法依赖于质粒瞬时化学转染HEK293细胞以递送这些组分并产生AAV。在第二种方法中，杆状病毒表达载体(BEV)将所述组分递送到无脊椎动物细胞的悬浮培养物中。虽然基于哺乳动物细胞的rAAV生产系统能够生产高滴度的AAV材料，但是其不太适合放大。这主要是由于质粒生产的高成本和需要使HEK293细胞既能适应悬浮生长又能适应AAV生产，并且甚至随后的产量与昆虫细胞的不是一个量级。相反，BEV生产系统为rAAV生产提供了一个更可扩展的平台，因为杆状病毒一旦产生并被鉴定，就可以在接种以生产AAV之前与悬浮生长的昆虫细胞一起扩增。通常，基于每细胞的产率与悬浮昆虫细胞和粘附的HEK293细胞相当。
[0004]用于在昆虫细胞中产生rAAV的最常用的方法是通过三种分离的杆状病毒的共感染，即TripleBac系统。这些杆状病毒分别包含Rep、Cap和转基因(Trans)表达盒。在rAAV生产过程中使用三种杆状病毒共感染的主要缺点是可能发生非同时感染。通过产生每种都含有双表达盒的杆状病毒载体，在此称作DuoBac系统(其中每种载体含有Cap和Rep或Cap和Trans，图1)，可以减少rAAV生产所需的不同杆状病毒载体的数量，从而提高同时感染的机会。这种工艺复杂性的降低具有几个潜在的好处：1.降低污染的风险；2.粗裂解物体积(CLB)中平均较高的AAV产率；3.更强健的杆状病毒MOI应答；4.增加了与放大的兼容性；5.由于少要求一种种子病毒，降低了商品成本；和6.降低AAV批次的总/全比率。产生所有这些
优点是因为成功生产AAV所需的分子组分更可能在正确的时间存在于细胞中。
[0005]对于在昆虫细胞中使用杆状病毒的AAV生产，优化Cap和Rep蛋白在时间和量上的表达对于所生产的AAV的数量和质量是非常重要的。先前观察到，早期Rep78表达(复制Rep)和晚期Rep52表达(包装Rep)提高了生产的AAV的质量(US8697417)。通过使用在不同感染阶段变得有活性的不同杆状病毒启动子，可以实现对表达时间的控制(Chaabihi,H.,et al.,1993,J Virol 67(5),2664
‑
71；Hill
‑
Perkins,M.S.and Possee,R.D.,1990,J Gen Virol 71(4),971
‑
6；Pullen,S.S.and Friesen,P.D.,1995,J Virol 69(1),156
‑
65)。立即早期(IE)启动子在杆状病毒感染的早期，在感染后立即有活性，但此后下降。P10和多角体蛋白启动子都是强启动子，但是非常迟的启动子，其中在感染后20
‑
24小时观察到峰值表达。通过分开Rep52和Rep78表达盒，并用不同的启动子控制它们的表达，本专利技术人更好地控制Rep蛋白的个体强度和时间，从而提高生产的AAV的质量。另外，在申请WO2002/148971中，本专利技术人通过使用Rep78和Rep52蛋白的单一编码序列显著提高了rAAV载体在昆虫细胞中产生的稳定性，其中对于Rep78蛋白使用了次优起始密码子，其被扫描中的核糖体部分地略过以允许翻译起始也发生在下游的Rep52蛋白起始密码子处。在WO2002/014445中，通过使用Rep52和Rep78的单独表达盒，再次提高了昆虫细胞中rAAV载体生产的稳定性，其中重复的编码序列在密码子偏性(codon bias)不同以减少同源重组。
[0006]衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的化学计量需要尽可能接近1:1:10的自然比例。VP1含有磷脂酶A2活性，一旦衣壳进入细胞，VP1对于内体逃逸是必需的。如果该比值落在其最佳值之外，则衣壳的效力将较低，例如，低VP1通常导致较差的感染性(如在细胞进入和转基因表达中所测量的)，但是产生较高滴度的AAV(以GC/mL计)。所选择的衣壳启动子和VP1起始密码子的组合一起对该比率产生最大的影响并需要以针对各个AAV血清型进行优化。混合不同的启动子强度和VP1起始密码子可以改变产生的衣壳的VP1:2:3比率，从而改变其效力(Bosma,B.,et al.,2018,Gene Ther 25(6),415
‑
424)。国际专利申请WO2002/084773公开了一种在昆虫细胞中产生rAAV的方法，其中通过相对于VP2和VP3补充VP1来增加感染性病毒颗粒的产生。补充可以通过将包含表达VP1、VP2和VP3的核苷酸序列的衣壳载体引入昆虫细胞中，并且另外将表达VP1的核苷酸序列引入昆虫细胞中来实现，所述核苷酸序列可以在相同的衣壳载体上，也可以在不同的载体上。
[0007]过去，含有双表达盒的杆状病毒构建体围绕AAV血清型1(W02002/104964)设计。虽然这些构建体显示出改进的总/全比和正常衣壳化学计量，但是病毒产率比TripleBac AAV1产量低大约三倍。降低产率的一个解释可能是由于使用单个Rep表达盒，其中表达的时机以及Rep52和Re本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含一或多种核酸构建体的细胞，所述一或多种核酸构建体包含：i)第一表达盒，其包含与编码mRNA的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子，所述mRNA在所述细胞中的翻译产生细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种；ii)第二表达盒，其包含与编码mRNA的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子，所述mRNA在所述细胞中的翻译产生细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种；iii)第三表达盒，其包含与编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列可操作地连接的第三启动子；以及，iv)核苷酸序列，其包含侧翼为至少一个细小病毒反向末端重复序列的转基因，其中，所述第一和第二表达盒中的至少一个和所述第三表达盒存在于第一核酸构建体上，并且其中，在用所述一或多种核酸构建体转染所述细胞后，所述第一启动子先于所述第二和第三启动子有活性。2.根据权利要求1的细胞，其中所述包含侧翼为细小病毒反向末端重复序列的转基因的核苷酸序列存在于第二核酸构建体上。3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述第二核酸构建体还包含第四表达盒，所述第四表达盒包含与编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列可操作地连接的第四启动子，其中第一启动子先于第二、第三和第四启动子有活性，其中任选地，所述第三和第四启动子是相同的，并且其中任选地，由第三和第四表达盒中的核苷酸序列编码的细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白是相同的。4.根据权利要求3所述的细胞，其中所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种以及所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种包含共同氨基酸序列，所述共同氨基酸序列包含所述细小病毒Rep52和40蛋白中至少一种的从第二个氨基酸到最C端氨基酸的氨基酸序列，其中所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种与所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列至少90％相同，并且其中编码所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列与编码所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列具有小于90％的相同性。5.根据权利要求4所述的细胞，其中所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种和所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列至少99％相同，优选100％相同。6.根据权利要求4或5所述的细胞，其中与编码所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列相比，编码所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列具有改善的针对所述细胞的密码子使用偏向性，或者与编码所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列相比，其中编码所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列具有改善的针对所述细胞的密码子使用偏向性，其中优选地，编码所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列与编码所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列的密码子适应指数之差至少...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：优尼科生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：