间充质谱系前体或干细胞的3D培养制造技术

本公开涉及不含血清的干细胞培养的经改进的方法，具体地涉及生物反应器中的3D培养以及供所述培养使用的细胞培养基和组合物。此类方法可以特别适于大规模细胞制造。方法可以特别适于大规模细胞制造。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】间充质谱系前体或干细胞的3D培养


[0001]本公开涉及不含血清的干细胞培养的经改进的方法，具体地涉及生物反应器中的3D培养以及供所述培养使用的细胞培养基和组合物。

技术介绍

[0002]多能间充质谱系细胞(MLC)因其高增殖和分化潜能以及免疫调节和其它有益特性而被提出作为治疗应用的有吸引力的候选物(Caplan AI(2007)《细胞生理学杂志(J.Cell Physiol.)》,213,341
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347；Prockop DJ(2007)《临床药理学与治疗学(Clin Pharmacol Ther.)》,82,241
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243)。然而，面临的最重要且最紧迫的挑战之一是，需要将细胞产物的高度个体化的体外要求转化为可再现、稳健且安全的大规模流线型生物过程。
[0003]用于分离和扩增MSC的常规培养基由限定的基础培养基(例如杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)或α改良最小必需培养基(α
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MEM))组成，所述培养基由于其高含量的刺激生长因子而补充有胎牛血清。虽然这些培养基总体上被报告为支持多次传代的MSC的增殖，但是已经出现了对由于与胎牛血清相关联的潜在风险的担忧(Dimarakis和Levicar(2006)《干细胞(Stem Cells)》,24,1407
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1408；Mannello和Tonti(2007)《干细胞》,25,1603
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1609)。具体地，胎牛血清可能含有有害污染物，如朊病毒、病毒和人畜共患病介质，并可能引发免疫反应。此外，胎牛血清的不良定义的性质以及其高度批次间差异可能使培养基的生长支持特性不一致，并因此使得细胞产生过程的标准化变得困难。
[0004]已经研究了人来源的补充物，如人血清和血小板裂解物，作为胎牛血清的替代物。人血清通常不被视为合适的替代物，因为其缺乏可用性并且其促生长潜力不一致。最近已提出将人血小板源性补充物，如血小板裂解物(hPL)和富含血小板的血浆，作为优质替代品(Doucet等人(2005)《细胞生理学杂志》,205,228
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236；Muller等人(2006),《细胞疗法(Cytotherapy.)》8,437
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444；Capelli等人(2007)《骨髓移植术(Bone Marrow Transplant.)》,40,785
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91；Lange等人(2007)《细胞生理学杂志》,213,18
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26；Reinisch等人(2007)《再生医学(Regen Med.)》,2,371
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82)。尽管这些研究表明合并的人血小板衍生物具有相当大的促生长特性，但其对MLC生长的影响不一致(Bieback等人(2008)《移注医学和血液疗法(Transfus Med Hemother.)》,35,286
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294)。此外，这些hPL调配物的高成本可能阻止商业细胞培养的脚步。
[0005]因此，对于支持在不含胎牛血清的细胞培养物中分离和快速扩增MSC的有成本效益的方法的需求仍未得到满足。

技术实现思路

[0006]诸位专利技术人发现，胎牛血清在三维(3D)生物反应器培养中是间充质谱系或干细胞生长的令人惊讶地不良的刺激物，但其在二维(2D)环境中是间充质谱系或干细胞生长的有效刺激物。因此，诸位专利技术人注意到，在2D环境中有效的生长培养基在3D环境中可能无效。
此外，通过从培养基中去除动物血清，诸位专利技术人发现其它非动物生长刺激物，如人血小板裂解物(hPL)，在促进干细胞在3D环境中的生长方面特别有效。因此，在一实例中，本公开涉及一种在三维培养中培养间充质谱系前体或干细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养间充质谱系前体或干细胞的群体，其中所述细胞培养基是不含动物血清的。
[0007]hPL包括各种生长因子，如血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)和表皮生长因子(EGF)。诸位专利技术人发现了PDGF和FGF2在3D环境中促进间充质谱系或干细胞的重要性。因此，在一实例中，所述培养基是不含动物血清的并且包括PDGF和FGF2。在另一实例中，所述培养基进一步包括EGF。在一实例中，在生物反应器中培养所述间充质谱系前体或干细胞。
[0008]诸位专利技术人还发现，当所述培养基不含动物血清时，在3D培养中在粘附材料上培养间充质谱系或干细胞对于在3D环境中生长是重要的。因此，在另一实例中，本公开涉及一种在三维培养中培养间充质谱系前体或干细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基中的粘附材料上培养间充质谱系前体或干细胞的群体，其中所述间充质谱系前体或干细胞附着到所述粘附材料上，并且其中所述细胞培养基是不含动物血清的。在一实例中，所述培养基进一步包括PDGF和FGF2。在另一实例中，所述培养基进一步包括EGF。在一实例中，在生物反应器中培养所述间充质谱系前体或干细胞。在一实例中，所述粘附材料为微载体。
[0009]诸位专利技术人随后发现，在3D培养中在某些粘附材料上培养间充质谱系前体或干细胞是有问题的，因为活细胞数量在峰细胞密度处或附近显著下降。令人惊讶的是，此问题通过在某些粘附材料，特别是可降解微载体，如具有可降解芯的那些微载体和/或低密度的微载体上培养间充质系或干细胞而得以缓解。因此，在一实例中，所述微载体是可降解的。在另一实例中，所述微载体具有可降解芯。在另一实例中，所述微载体具有碳水化合物聚合物或糖蛋白芯。
[0010]在各个实例中，如微载体等所述粘附材料可以是包被的。在一实例中，所述粘附材料是包被的。在另一实例中，所述微载体是包被的。在一实例中，用糖蛋白包被所述粘附材料或所述微载体。在一实例中，所述糖蛋白为胶原蛋白或玻连蛋白。在一实例中，所述玻连蛋白为人玻连蛋白或其合成模拟物。玻连蛋白的合成模拟物能够与间充质谱系前体或干细胞结合并支持间充质谱系前体或干细胞在其表面上生长。在另一实例中，所述糖蛋白是合成的。因此，在一实例中，本公开涵盖3D细胞培养，其包括在细胞培养基中的粘附材料上培养间充质谱系前体或干细胞的群体，其中所述间充质谱系前体或干细胞附着到所述粘附材料上，其中所述细胞培养基是不含动物血清的，并且其中用如粘连蛋白或胶原蛋白等糖蛋白包被所述粘附材料。
[0011]在另一实例中，所述微载体包括碳水化合物聚合物芯，其中所述碳水化合物聚合物以钙依赖性方式连接。
[0012]在一实例中，所述微载体的密度为约0.5g/ml至5g/ml。在另一实例中，所述微载体的密度为约0.5g/ml至3g/ml。在一实例中，所述培养基包括0.5g/L至5g/L的微载体。在另一实例中，所述培养基包括0.5g/L至3g/L的微载体。在另一实例中，所述培养基包括0.5g/L至2g/L的微载体。在另一实例中，所述培养基包括约1g/L的微载体。
[0013]在一实例中，所述微载体是多孔的。在另本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在三维培养中培养间充质谱系前体或干细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基中的粘附材料上培养间充质谱系前体或干细胞的群体，其中所述间充质谱系前体或干细胞附着到所述粘附材料上，并且其中所述细胞培养基是不含动物血清的。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养基包括血小板源性生长因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞培养基还包括EGF。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在生物反应器中培养所述间充质谱系前体或干细胞。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述粘附材料为微载体。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述微载体具有可降解芯。7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述微载体具有碳水化合物聚合物或糖蛋白芯。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中用糖蛋白包被所述粘附材料或所述微载体。9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述糖蛋白为胶原蛋白或玻连蛋白。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述玻连蛋白为人玻连蛋白或其合成模拟物。11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述糖蛋白是合成的。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述碳水化合物聚合物以钙依赖性方式连接。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述培养基包括0.5g/L至5g/L的微载体。14.根据权利要求5至13中任一项所述的方法，其中所述微载体为多孔微载体。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述微载体为大孔微载体。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述培养基是不含动物组分的。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中每培养24小时更换约70％的培养基。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其进一步包括通过使所述间充质谱系前体或干细胞与解离剂接触而使所述间充质谱系前体或干细胞与所述粘附材料解离。19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其进一步包括使所述粘附材料以足以将所述间充质谱系前体或干细胞从所述粘附材料释放的频率和振幅振动一定时间段。20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其进一步包括使所述粘附材料降解。21.根据权利要求20所述的方法，其中通过向所述培养基中添加酶使所述粘附材料降解。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中间充质谱系前体或干细胞以5,000个细胞/ml至20,000个细胞/ml接种。23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中间充质谱系前体或干细胞以10,000个细胞/ml接种。24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中间充质谱系前体或干细胞已经从主细胞库中培养扩增。25.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：迈索布拉斯特国际有限公司，
类型：发明
国别省市：