新的核酸配体及其鉴定方法技术

根据本申请的一个方面涉及一种新的核酸配体，其是一类新的核酸化合物，其存在在现有技术中被认为是不可能的。该新的核酸配体对具有三维结构的至少两种不同靶标具有特异性结合亲和力，并且用于该至少两种靶标的结合位点在单个核酸配体中形成或由单个核酸配体形成。根据本申请的新的核酸配体可以同时解决现有技术不能解决的现有适配体的若干问题。根据本申请的一个方面涉及用于鉴定上述新的核酸配体的新的筛选方法。该新的筛选方法利用依次接触具有三维结构的至少两种不同靶标的步骤来筛选以前认为不可能的新的核酸配体。筛选以前认为不可能的新的核酸配体。筛选以前认为不可能的新的核酸配体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新的核酸配体及其鉴定方法


[0001]本申请涉及新的核酸配体及其鉴定方法。

技术介绍

[0002]1.用于适配体检测的SELEX技术
[0003]适配体是可以与各种类型靶标结合的单链核酸(DNA或RNA)片段，包括低分子化合物和蛋白，具有高亲和力和特异性。适配体只能特异性地结合靶标分子，因此结合亲和力非常高，从几μM到几nM的水平。与单克隆抗体类似，适配体特异性识别并结合靶标。因此，适配体能代替单克隆抗体用于诊断试剂、分析试剂、有害物质检测等，并且可应用于生物传感器、生物成像、药物递送和药物领域。例如，自2004年FDA批准的作为治疗黄斑变性药物的第一个适配体药物Macugen以来，基于适配体的药物在世界范围内得到了积极的研究和开发。在韩国，学术界和生物技术公司对适配体越来越感兴趣。
[0004]适配体的检测和开发通过被称为指数富集的配体系统进化技术(SELEX)的方法来完成。SELEX最早开发于1990年，是一种从具有随机序列的核酸文库中反复筛选与所需靶标结合的寡核苷酸，由此可以获得对“一种特定靶标”具有高结合亲和力的核酸适配体的方法。也就是说，在SELEX方法中，从SELEX核酸文库中选择结合靶标的寡核苷酸，并使之与未结合靶标的寡核苷酸分开，其中SELEX核酸文库包括10
14
至10
16
个单链随机寡核苷酸，每个寡核苷酸通常由40至100个核苷酸组成。结合靶标的寡核苷酸通过PCR扩增，然后经扩增的寡核苷酸再次用作文库池(library pool)。将上述选择过程重复几次，以排除未结合靶标的寡核苷酸，从而获得以高亲和力与“仅一种靶标”特异性结合的适配体。
[0005]基于这种技术，研究和开发聚焦于如何更快且更准确地检测和筛选与一种靶标特异性结合的适配体，或者如何寻找实际上具有效用或治疗效果的适配体。例如，在经典SELEX过程中，研究和开发聚焦于改变结合条件、进行选择的平台、靶标的类型、核酸文库的设计，或者寡核苷酸文库固定于其上的基质，以简化该过程或产生改进的适配体(非专利文献1)。因此，在最初的经典SELEX之后，开发了阴性SELEX(Negative SELEX)和反向SELEX(Counter SELEX)，并且此后，开发了另外的技术，诸如IP
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SELEX、捕获
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SELEX、细胞
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SELEX、CE
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SELEX、M
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SELEX、AFM
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SELEX、AEGIS
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SELEX和动物
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SELEX(Animal
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SELEX)(非专利文献1)。
[0006]迄今为止，已经开发的SELEX和适配体研究的方向具有不变的前提条件，即寡核苷酸仅与一种靶标结合。该方向是找出仅对一种靶标具有特异性结合亲和力的寡核苷酸，即适配体。正在进行各种额外的研究，以将通过现有SELEX方法开发和研究的适配体用于各种目的，但是在将适配体用作药物时出现了下述问题。
[0007]2.来自常规SELEX技术的适配体的局限性
[0008]通过常规SELEX技术获得的适配体由于其物理化学性质而在体内实际用作药物具有致命缺点。也就是说，由于核酸酶降解导致的不稳定性和快速肾清除已经成为适配体临床应用的主要障碍(非专利文献2)。已经进行了各种研究来解决这些问题。
[0009]由于被通常存在于活体内的核酸酶降解，适配体在血清中具有约5分钟的半衰期，在细胞中具有约1小时的半衰期(非专利文献3)。为了保护适配体免受核酸酶降解，可以对适配体进行化学修饰，其中已知各种方法，例如修饰寡核苷酸的两端、核酸的糖结构或者磷酸二酯主链。此外，适配体具有小于5nm的平均直径，以及约6至30kDa的分子量。因此，尽管通过使用经修饰的核苷酸在一定程度上解决了适配体的代谢不稳定性，但是适配体的临床应用受限于通过血管施用的适配体由于其分子量小而通过肾迅速从体内排出，因此具有缩短的停留时间(非专利文献2)。为了克服这个问题，适配体被配制成与大分子，诸如聚乙二醇(PEG)、蛋白、胆固醇、脂肪酸或脂质体缀合的形式，因此不容易通过肾脏过滤，从而延长了在体内的停留时间。其中，PEG的应用最为广泛。
[0010]然而，为单链寡核苷酸的适配体天然形成各种三维形状，诸如螺旋和环，并且这些三维结构参与靶标识别和结合。适配体对靶的亲和力和特异性敏感地受到其结构的影响。因此，足以预测的是，SELEX后过程中用大分子对适配体的修饰会对适配体的性质和折叠结构产生的不利影响。
[0011]特别是，已有案例报道，由于体内已经存在针对PEG的抗体，使用PEG化的适配体来增加适配体在体内的循环半衰期在III期试验中引起严重的过敏反应(非专利文献4)。此外，将适配体与大分子(诸如PEG)一起使用可能会失去治疗作用，这是因为这种分子会影响适配体的结构而使得对所需靶标的亲和力或特异性降低。此外，适配体的修饰或者适配体与其他物质的使用可能会改变适配体生产中每批次中适配体的品质或性能，因此难以恒定地控制适配体的品质，且因此，当将适配体实际制成药物时，不能确保其效果的一致性。品质控制所需的高成本降低了适配体生产成本低的优势。
[0012]此外，迄今为止研究的适配体不能通过细胞膜主动地单独递送到细胞质中。因此，已经开发的大多数适配体为仅靶向膜蛋白或分泌蛋白，并且靶向细胞质或胞内细胞器的膜中存在的蛋白的适配体主要选自经纯化的蛋白，其中载体，诸如转铁蛋白、胆固醇和脂质体被用于提高所选适配体的细胞渗透性。因此，为了将适配体用作实际应用于临床试验的药物，需要克服各种问题，并且已经进行了多种尝试来克服这些问题，但是最终，失败的案例不断出现在临床试验中。Macugen是迄今为止唯一被批准的适配体药物。因此，持续需要一种新的物质，其可以通过解决适配体的问题而被临床使用并实现为实际药物。
[0013]3.双特异性适配体及其局限性
[0014]如上所述，适配体具有仅结合一种靶标的性质。为了克服这一局限性，已经持续研究了双特异性或多特异性适配体，其具有对不同靶标具有特异性结合亲和力的两个或更多个适配体。
[0015]双特异性适配体由两个不同的适配体组成，并且这种特征可以促进或调节例如功能性分子和靶标细胞之间的免疫反应，因此已经主要在免疫抗癌药物领域进行了持续研究(非专利文献5)。
[0016]然而，构成双特异性适配体的每个单特异性适配体具有特异性结合其靶标的独特结构，因此这些在有或没有接头的情况下相互偶联的适配体可能相互干扰，因此可能会影响每个适配体的特异性结合亲和力。特异于不同靶标的两个适配体的简单结合不能保持对两种靶标的结合亲和力完整，也不能确保这一点。因此，为了获得正确发挥功能的双特异性适配体，难以通过无数次试验和错误来找到既不相互干扰也不影响彼此结构的适配体。而
且，需要检查接头是否不影响适配体，甚至在适配体的偶联期间也需如此(专利文献2：美国专利No本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对两种或更多种不同靶标具有特异性结合亲和力的非天然核酸配体，其中所述靶标中的每一种具有三维结构，并且其中所述非天然核酸配体不是多个适配体的偶联体(非偶联的)。2.一种对两种或更多种不同靶标具有特异性结合亲和力的非天然核酸配体，其中所述靶标中的每一种具有三维结构，并且其中在所述核酸配体中，形成一种靶标的结合位点的全部或部分核酸序列构成形成另一种靶标的结合位点的全部或部分核酸序列。3.一种对两种或更多种不同靶标具有特异性结合亲和力的非天然核酸配体，其中所述靶标中的每一种具有三维结构，并且其中在所述核酸配体中，用于两种或更多种靶标的结合位点不是彼此分开存在的。4.一种对两种或更多种不同靶标具有特异性结合亲和力的非天然核酸配体，其中所述靶标中的每一种具有三维结构，并且其中用于两种或更多种靶标的结合位点在一个单一核酸配体中形成。5.根据权利要求2所述的非天然核酸配体，其中，核酸序列形成所述靶标的结合位点的部分占所述非天然核酸配体的整个序列的约1％至约99％，约5％至约95％，约10％至约90％，约20％至约80％，约30％至约70％，或约40％至约60％。6.根据权利要求1至4中任一项所述的非天然核酸配体，其中，所述非天然核酸配体对两种不同靶标具有特定结合特异性。7.根据权利要求1至4中任一项所述的非天然核酸配体，其中，所述靶标选自由细胞、病毒和蛋白组成的组。8.根据权利要求6所述的非天然核酸配体，其中，所述靶标之一是血浆蛋白，并且另一种靶标是治疗性靶标。9.根据权利要求8所述的非天然核酸配体，其中，所述血浆蛋白选自由白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、脂蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白和甲状腺素运载蛋白组成的组。10.根据权利要求8所述的非天然核酸配体，其中，所述治疗性靶标是细胞中存在的蛋白或细胞膜中存在的蛋白。11.根据权利要求8所述的非天然核酸配体，其中，所述治疗性靶标选自由膜蛋白、跨膜蛋白、糖蛋白、免疫抗体、病毒、病毒包膜糖蛋白、病毒酶、分泌蛋白、丝氨酸蛋白酶、肽激素、神经递质、激素、脱氢酶、细胞因子、E3泛素连接酶、神经肽、水解酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、磷酸酶、趋化因子蛋白、甲基转移酶、氧化酶、生长因子、细菌、细菌蛋白、胞内蛋白、胞外基质、受体、转录因子和肿瘤蛋白组成的组。12.根据权利要求8所述的非天然核酸配体，其中，所述治疗性靶标选自由4
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1BB、乙酰胆碱受体、α凝血酶、胰淀素、血管生成素1、血管生成素2、AXL、BCL
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2、BMPR
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1R、BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRDT、BTLA、降钙素基因相关肽、CREB结合蛋白(CPB)、CCK4/PTK7、CD16a、CD16b、CD19、CD20、CD200、CD200R、CD27、CD28、CD3、CD30、CD32A、CD32B、CD33、CD4、CD40L、CD52、CD80、CD94、CSF1R、CTLA
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4、DDR1、DDR2、E2F1、EGFR、EPH、ERBB2、FGF、FGFR、胃饥饿素、GITR、磷酯酰肌醇蛋白聚糖3、促性腺激素释放激素1、HIV gp120、HIV
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1整合酶、HIV
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1逆转录酶、HRAS、HVEM、ICOS、IDH1、IGF1R、免疫球蛋白E、干扰素
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γ、KIT、KRAS、LAG3、LFA、L
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选择素、
LTK、MDM2、MDMX、粘蛋白1、MYC、神经降压素1、中性粒细胞弹性蛋白酶、NF
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Kb、NKG2D、痛敏肽、NTRK1、NTRK2、OX
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40、PD
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1、PDGF、PDGFR家族、PD
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L1、PD
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L2、磷脂酶A2、纤溶酶原激活物抑制剂1、PP2A、PPM1D、PPP2CA、蛋白酪氨酸磷酸酶、P
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选择素、PSMA、呼吸道合胞病毒、RET、SDF1b、SetDB1、SLAMF7、葡萄球菌肠毒素B、STAT3、腱生蛋白、TGFBR、TIGIT、TIM3、TNFSF7、酪氨酸酶、VCAM
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1、VEGF、VEGFR家族、α
v
β3整合蛋白，以及它们的突变体组成的组。13.根据权利要求8所述的非天然核酸配体，其中，所述治疗性靶标选自由KRAS G12D、KRAS G12V、KRAS G12C、KRAS G12A、KRAS G12S、KRAS G12R、KRAS G13D、KRAS Q61H，及它们的组合组成的组。14.根据权利要求1至4中任一项所述的非天然核酸配体，其中，所述非天然核酸配体由约100个或更少的核苷酸组成。15.根据权利要求14所述的非天然核酸配体，其中，所述核苷酸选自由DNA核苷酸、RNA核苷酸、其经修饰的核苷酸，及它们的组合组成的组。16.根据权利要求1至4中任一项的非天然核酸配体，其中，所述非天然核酸配体由选自由SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:183组成的组中的一种核酸序列组成。17.根据权利要求1至4中任一项所述的非天然核酸配体，其中，所述核酸选自由单链RNA、双链RNA、单链DNA和双链DNA组成的组。18.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其中，所述药物组合物包含权利要求1至4中任一项的非天然核酸配体。19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中，所述非天然核酸配体对作为第一靶标的血浆蛋白和作为第二靶标的治疗性靶标蛋白具有特异性结合亲和力。20.根据权利要求18所述的药物组合物，其中，所述药...

【专利技术属性】
技术研发人员：李钟旭，李仲桓，金岛永，朴韩瑟，李世娜，李茶经，金昭沇，崔智雅，
申请(专利权)人：因特欧力多公司，
类型：发明
国别省市：