一种融合基因、表达载体及抗糖尿病药物筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种融合基因、表达载体及抗糖尿病药物筛选方法，该方法以真核表达载体pCDNA3.1为基础，插入人工合成的EBFP2

【技术实现步骤摘要】
一种融合基因、表达载体及抗糖尿病药物筛选方法


[0001]本专利技术涉及生物医药工程
，特别是一种融合基因、表达体系及其在以SGLT2蛋白为靶点的抗糖尿病药物筛选方法的建立及应用。

技术介绍

[0002]根据国际糖尿病联合会（International Diabetes Federation，IDF）第10版《全球糖尿病地图》数据显示，截止2021年12月全球20
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79岁成年人糖尿病患者达5.37亿（10.5%），糖尿病总人数预计到2030年将增至6.43亿（11.3%），到2045年将增至7.83亿（12.2%）。中国成年人糖尿患者达1.409亿，总人数居于全球首位，预计至2045年将达到1.744亿。糖尿病已经成为一种全球性的多发性疾病，严重威胁人类的生命健康。
[0003]血糖平衡对人体的新陈代谢至关重要，而维持循环系统血糖平衡需要多个器官的协调作用，例如消化道对碳水化合物的吸收转化、组织器官对葡萄糖的摄取和利用，肝脏中汤圆的合成与分解、胰腺对血糖稳态的调节等，还包括肾脏在血糖平衡调节中也发挥重要作用。肾脏主要通过三方面对血糖水平进行调节：（1）肾脏葡萄糖通过糖异生进入血液循环；（2）肾脏活动对葡萄糖的消耗利用；（3）肾脏对葡萄糖的重吸收。研究发现，健康成年人肾脏中的肾小球每天约过滤180g的葡萄糖，而其中约99%被肾近端小管重吸收进入血液循环，剩余1%则以尿液形式排出体外。肾脏中对葡萄糖重吸收起重要作用的跨膜转运蛋白主要有钠
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葡萄糖1型转运体和钠
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葡萄糖2型转运体（SGLT1和SGLT2），其中SGLT1是一种低容量、高亲和力的转运体，以钠
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葡萄糖2:1的比率转运葡萄糖和半乳糖，负责转运肾脏内约10%的葡萄糖重吸收，但因为SGLT1在小肠和其他组织中也有广泛表达，SGLT1的抑制有可能导致葡萄糖
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半乳糖吸收不良综合征以及胃肠道相关的副作用。SGLT2是一种高容量、低亲和力的转运体，以钠
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葡萄糖1:1的比率转运葡萄糖，负责肾脏90%葡萄糖的重吸收。另外，因SGLT2主要分布于肾脏，葡萄糖重吸收率高，选择性阻断SGLT2能特异性地抑制肾脏葡萄糖的重吸收，促使葡萄糖从尿液排出体外，从而达到降低血糖浓度的作用。综上所述，SGLT2是目前比较理想的抗糖尿病药物作用靶点，而且SGLT2抑制剂不依赖于胰岛素作用，可用于糖尿病发展的任何阶段。一系列临床数据显示SGLT2抑制剂的服用在有效控制血糖的同时，还能够改善β细胞功能、提高胰岛素敏感性、降低患者体重、减轻心血管并发症几率。
[0004]以SGLT2为靶点的抗糖尿病药物筛选方法已有报道，该系统以增强型绿色荧光蛋白（eGFP）作为报告基因，通过转染panc
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1胰腺细胞作为细胞模型，以绿色荧光葡萄糖分子（2
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BNDG）作为底物，通过流式检测2
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BNDG信号来评价药物对SGLT2抑制活性，所存在的问题：该筛选系统所采用报告基因eGFP和底物分子2
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BNDG的激发波长均为488 nm，仅发射波长分别为507 nm和542 nm，采用流式细胞仪难以准确排除eGFP的干扰而获得准确的2
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BNDG的荧光值，导致背景高、灵敏度低；该筛选系统所采用的细胞为panc
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1胰腺细胞，而不是SGLT2表达及发挥转运葡萄糖分子功能的人肾脏来源的细胞，所体现的葡萄糖转运效率及作用可能与体内实际情况
存在差异；该筛选平台的建立需构建过表达稳转细胞系，方法单一，步骤繁琐；该筛选系统中细胞荧光信号需要昂贵的流式细胞仪检测，检测方法复杂，不适合药物的高通量筛选。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种融合基因、表达载体及抗糖尿病药物筛选方法，以解决上述技术背景中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案来实现：第一方面，本专利技术提供了一种融合基因，所述融合基因是蓝色荧光蛋白基因EBFP2、自裂肽基因T2A和人源钠
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葡萄糖转运蛋白基因SGLT2的融合；所述融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0007]上述技术方案中，所述融合基因的制备方法为：先将蓝色荧光蛋白基因EBFP2先与自裂肽基因T2A通过PCR方法拼接成融合基因EBFP2
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T2A，然后再将以上融合基因EBFP2
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T2A通过PCR方法与人源基因SGLT2拼接起来，最终得到完整融合基因EBFP2
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T2A
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SGLT2，即融合基因；其中，所述蓝色荧光蛋白基因EBFP2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述自裂肽基因T2A，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述人源钠
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葡萄糖转运蛋白基因SGLT2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0008]第二方面，本专利技术提供了一种基于第一方面所述融合基因的表达体系，该表达体系包含所述融合基因插入过表达载体pCDNA3.1获得融合基因过表达载体pBTS，或融合基因亚克隆至慢病毒载体获得融合基因过表达慢病毒颗粒Levi_BTS，或融合基因亚克隆至腺病毒载体获得融合基因过表达腺病毒颗粒Ad_BTS；然后通过转染或感染细胞获得过表达融合蛋白细胞株。
[0009]上述技术方案中，该表达体系还包含基于融合基因而构建的腺相关病毒AAV_BTS，腺相关病毒AAV_BTS用于后续小鼠动物实验。
[0010]上述技术方案中，该表达体系以蓝色荧光蛋白EBFP2作为报告基因，同时其荧光值亦可作为后续评价SGLT2活性的内参。
[0011]第三方面，本专利技术提供了基于第一方面所述融合基因的抗糖尿病药物筛选方法，包括以下步骤：（1）基于融合基因EBFG2
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T2A
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SGLT2构建融合基因过表达载体pBTS；（2）将融合基因过表达载体pBTS转染细胞建立融合基因过表达细胞模型；（3）该细胞模型采用EBFP2作为报告基因，以2
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BNDG作为SGLT2作用底物而建立药物抗糖尿病评价体系，并通过计算2NBDG与EBFP2荧光比值初步评价药物对SGLT2抑制效果，间接评估药物可能的抗糖尿病作用。
[0012]上述技术方案中，步骤（2）中细胞模型的建立方法替换成通过包装含融合基因的腺病毒或慢病毒感染的方式建立。
[0013]上述技术方案中，步骤（2）中所采用转染的细胞为ATCC来源人胚胎肾细胞HEK293。
[0014]上述技术方案中，所述筛选方法是以过表达SGLT2蛋白作为药物靶标。
[0015]上述技术方案中，步骤（1）中，以pCDNA3.1为基础骨架，在多克隆位点插入融合基因片段而获得过表达载体pBTS。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因是蓝色荧光蛋白基因EBFP2、自裂肽基因T2A和人源钠
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葡萄糖转运蛋白基因SGLT2的融合；所述融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述融合基因，其特征在于，所述融合基因的制备方法为：先将蓝色荧光蛋白基因EBFP2与自裂肽基因T2A通过PCR方法拼接成融合基因EBFP2
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T2A，然后再将以上融合基因EBFP2
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T2A通过PCR方法与人源基因SGLT2拼接起来，最终得到完整融合基因EBFP2
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T2A
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SGLT2，即融合基因。3.一种基于权利要求1
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2任一项所述融合基因的表达体系，其特征在于，该表达体系包含所述融合基因插入过表达载体pCDNA3.1获得融合基因过表达载体pBTS，或融合基因亚克隆至慢病毒载体获得融合基因过表达慢病毒颗粒Levi_BTS，或融合基因亚克隆至腺病毒载体获得融合基因过表达腺病毒颗粒Ad_BTS；然后通过转染或感染细胞获得过表达融合蛋白细胞株。4.根据权利要求3所述的一种融合基因表达体系，其特征在于，该表达体系还包含基于融合基因而构建的腺相关病毒AAV_BTS，腺相关病毒AAV_BTS用于后续小鼠动物实验。5.根据权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘超，杨晓松，刘秀芬，张飞雪，
申请(专利权)人：湖北科技学院，
类型：发明
国别省市：