ProteinA免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、ProteinA抗体及其应用技术

本发明专利技术提供一种Protein A免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其步骤包括：(1)用Protein A蛋白免疫公鸡，提取淋巴细胞的总RNA，逆转录成cDNA；(2)利用PCR技术扩增重链可变区和轻链可变区片段并拼接成scFv基因；(3)构建pCANTAB5E

【技术实现步骤摘要】
Protein A免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、ProteinA抗体及其应用


[0001]本专利技术专利涉及一种Protein A免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、Protein A单克隆抗体及其应用，以及含有该抗体的Protein A检测试剂盒，属于生物工程


技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌细胞壁中的A蛋白(Staphylococal ProteinA，SPA)又称Protein A，是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，分子量42kDa，能特异性地与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合，通常在大规模抗体制备中用于纯化IgG。Protein A分为天然Protein A、天然重组Protein A以及非天然重组Protein A，这些Protein A通常与琼脂糖、树脂等相偶联用于制备亲和层析柱。在抗体药生产中，下游亲和层析过程中Protein A会不可避免的与目标抗体蛋白一起被洗脱下来，从而在最终纯化步骤中产生Protein A残留。这种杂质会严重影响产品质量、药效以及安全性。
[0003]WHO、ICH(国际人用药品注册协调会)、中国药典、USP<130>均对Protein A残留量做出了相关限定。《中华人民共和国药典》2020年版第三部，《人用重组单克隆抗体制品总论》中3.2.4工艺相关杂质中提出“采用适宜的方法对供试品宿主蛋白质、宿主细胞和载体DNA、蛋白A及其他工艺相关杂质进行检测”。《尼妥珠单抗注射液》3.1.3.3蛋白质A残留量中提出“用酶联免疫吸附法(通则3429)测定，蛋白质A残留量应不高于蛋白质总量的0.001％。”2005年药品审批中心《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》，建议融合蛋白及单抗类制品Protein A残留量检测可以采用ELISA法。
[0004]因为Protein A是生物制品生产质控中必不可少的一个环节，且在工艺研究、终产品质量控制中都需要进行残留检测，所以研发一款基于ELISA方法的Protein A检测试剂盒是有必要的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种Protein A免疫噬菌体展示抗体库的构建方法。
[0006]一种Protein A免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征在于其步骤包括：
[0007](1)用Protein A蛋白免疫公鸡，提取淋巴细胞的总RNA，逆转录成cDNA；
[0008](2)利用PCR技术扩增重链可变区和轻链可变区片段并拼接成scFv基因；
[0009](3)构建pCANTAB5E
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2SFi1
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scFv重组质粒，电转化至TG1感受态细胞，构建噬菌体单链抗体库；
[0010](4)特异性富集噬菌体单链抗体库，从中筛选出阳性克隆；
[0011](5)将阳性单链抗体转化成IgY抗体，并在真核表达系统中进行表达；
[0012](6)IgY抗体的纯化
[0013](7)IgY抗体作为原料应用于ELISA检测试剂盒
[0014]步骤(2)中PCR技术使用的引物如下：
[0015][0016]步骤(2)中重链VH上游引物IgY
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sfi1
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VH
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F和下游引物IgY
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VH
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R混合进行PCR，轻链VL上游引物IgY
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VL
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F和下游引物IgY
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sfi1
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VL
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R混合进行PCR，将获得的轻链VL和重链VH的PCR产物回收并等物质的量混合作为模板，使用引物表中相对应的重链上游引物和轻链下游引物进行PCR。
[0017]步骤(4)中特异性富集噬菌体单链抗体库具体指取抗原用PBS，混匀后包被于96孔板，用5％BSA作为封闭液，添加噬菌体单链抗体库后室温孵育；
[0018]洗脱：加入100mM HCl，室温孵育5min后，用枪头用力吹打后收集，收集管内加入1MTris
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HCl中和pH，再加入1％BSA溶液稀释；
[0019]洗脱产物扩增：取洗脱产物加入TG1菌液中培养，加入M13KO7辅助噬菌体继续培养，菌液离心，用2
×
YT培养基重悬沉淀，过夜震荡培养；第二天将菌液离心，上清液体转移至新的离心管，加入PEG
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NaCl，冰上静置沉析后离心，然后去除上清，用1％BSA溶液重悬沉淀，转至另一EP管，离心，去除沉淀，上清即为扩增富集产物；
[0020]重复上述步骤，进行4轮淘选，提高每轮淘选严苛程度，富集得到具有亲和力的噬菌体。
[0021]步骤(5)中使用引物如下：
[0022][0023][0024]步骤(5)中将单链抗体转化成IgY具体指，将单链抗体的轻重链抗体基因克隆到pfuse(该载体已分别预先插入了IgY的重链和轻链恒定区基因)表达载体中，构建成完整的IgY重链和轻链表达载体。
[0025]本专利技术还公开了一种抗Protein A的IgY单克隆抗体，依次命名为IgY
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80、IgY
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81。
[0026]其中ProteinA抗体IgY
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80，其氨基酸序列为：
[0027]重链可变区序列为：
[0028]AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKASGFTFSDRGMHWVRQAPGKGLEWVAGTYTSGSITYYAPAVNGRATISRDNGQSTLRLQLNNLRAEDSGTYYCARDFGPSGWNAGSIDAWGHGTEVIVSS(SEQ ID No.1)，
[0029]其中重链可变区CDR1氨基酸序列为：DRGMH，
[0030]重链可变区CDR2氨基酸序列为：GTYTSGSITYYAPAVNG，
[0031]重链可变区CDR3氨基酸序列为：DFGPSGWNAGSIDA。
[0032]轻链可变区序列为：
[0033]QAALTQPSSVSANLGGTVKITCSGGGSRYGYMYGWIQQTSPGSAPVTVIYDNTNRPSNIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVQAEDEAVYFCGSYEGTTLTFGAGTTLTVL(SEQ ID No.2)，
[0034]其中轻链可变区CDR1氨基酸序列为：SGGGSRYGYMYG，
[0035]轻链可变区CDR2氨基酸序列为：DNTNRPS，
[0036]轻链可变区CDR3氨基酸序列为：GSYEGTTLT。
[0037]其中ProteinA抗体IgY
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81，其氨基酸序列为：
[0038]重链可变区序列为：
[0039]AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSNGMGWVRQAPGKGLEYVASISNDGS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Protein A免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征在于其步骤包括：(1)用Protein A蛋白免疫公鸡，提取淋巴细胞的总RNA，逆转录成cDNA；(2)利用PCR技术扩增重链可变区和轻链可变区片段并拼接成scFv基因；(3)构建pCANTAB5E
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2sfi1
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scFv重组质粒，电转化至TG1感受态细胞，构建噬菌体单链抗体库；(4)特异性富集噬菌体单链抗体库，从中筛选出阳性克隆；(5)将阳性单链抗体转化成IgY抗体。2.权利要求1所述的Protein A免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征为：步骤(2)中PCR技术使用的引物如下：IgY
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VH
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F：TCGGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGCCGTGACGTTGGACGAGGCGCTGACTCAGCCGTCGTCGGTGTCIgY
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VH
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R：GGCCAGATCGGCCTAGGACGGTCAGGGTYGIgY
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VL
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F：GGCCCAGCCGGCCGCCGTGACGTTGGACGAGIgY
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VL
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R：CACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC。3.根据权利要求2所述的Protein A免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征为：步骤(2)中重链VH上游引物和下游引物混合以步骤(1)的cDNA为模板进行PCR，轻链VL上游引物和下游引物混合以步骤(1)的cDNA为模板进行PCR，将获得的轻链VL和重链VH的PCR产物回收并等物质的量混合作为模板，使用引物中相对应的重链上游引物和轻链下游引物进行PCR。4.根据权利要求3所述的Protein A免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征在于：步骤(4)中特异性富集噬菌体单链抗体库，具体指取抗原与PBS混匀后，包被于96孔板，用5％BSA溶液封闭，添加噬菌体单链抗体库，加入BSA溶液孵育；洗脱：加入100mM HCl，室温孵育5min后，用枪头用力吹打后收集，收集孔内加入1M Tris
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HCl中和pH混匀；洗脱产物扩增：取洗脱产物加入TG1菌液中培养，加入辅助噬菌体继续培养，菌液离心，用2
×
YT培养基重悬沉淀，过夜震荡培养；第二天将菌液离心，上清液体转移至新的离心管，加入PEG
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NaCl，冰上静置沉析后离心，然后去除上清，用1％BSA溶液重悬沉淀，转至另一EP管，离心，去除沉淀，上清即为扩增富集产物；重复上述步骤，进行4
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5次淘选，提高每轮淘选严苛程度，富集得到具有亲和力的噬菌体。5.一种ProteinA抗体IgY
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80，其特征在于其氨基酸序列为：重链可变区序列为：AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKASGFTFSDRGMHWVRQAPGKGLEWVAGTYTSGSITYYAPAVNGRATISRDNGQSTLRLQLNNLRAEDSGTY...

【专利技术属性】
技术研发人员：易红飞，朱倩静，向蜀州，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：