一种制备抗花瓣侵染病害转基因材料的方法技术

本发明专利技术提供了一种制备抗花瓣侵染病害转基因材料的方法，具体为：先构建花瓣特异性表达载体，该表达载体包含花瓣特异性启动子以及核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示目的基因CmYC1；再将花瓣特异性表达载体转化至农杆菌，通过农杆菌转化子介导受体植物转化。该方法将花瓣特异性启动子和抑菌蛋白CmYC1的编码基因导入受体植物中得到转基因材料，基于菌核病的病害循环，该转基因材料能有效抑制花瓣介导的核盘菌侵染，达到控制菌核病的目的，而且该转基因材料同样有望用于其他花瓣侵染病害(如灰霉病)的防治，为病害防治提供了新思路。为病害防治提供了新思路。为病害防治提供了新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种制备抗花瓣侵染病害转基因材料的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种创制能抗花瓣侵染病害如菌核病、灰霉病的转基因载料的方法。

技术介绍

[0002]核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种世界性分别的重要植物病原真菌，寄主范围广泛，可以侵染600多种植物，包括油菜、大豆、向日葵、黄瓜、番茄、辣椒、茄子、莴苣、胡萝卜、豌豆等重要经济作物。核盘菌引起油菜菌核病是我国油菜生产上的首要病害。该病害年均发生面积占油菜种植面积的43.4％，危害损失占油菜病虫害总损失的55.6％，已成为影响我国油菜安全生产的最大威胁。核盘菌主要以菌核在植物病残体或土壤中越冬越夏。在翌年春季油菜初花期时(潮湿低温4
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20℃条件下)，菌核萌发形成子囊盘，释放子囊孢子随气流传播后沉降到植物组织表面。核盘菌是一种死体营养型病原真菌，子囊孢子在健康油菜叶片和茎秆上不能直接侵染，必须借助外源营养(如花瓣、衰老或坏死组织等)才能萌发产生芽管，形成菌丝来侵染植物组织。子囊孢子与油菜花瓣接触后借助花瓣作为外源营养萌发、生长侵染花瓣组织，被侵染的花瓣飘落到叶片上，引起叶片发病。病叶腐烂后黏附到茎秆上再引起茎秆发病。油菜菌核病的发病率与初花期花瓣被子囊孢子侵染的百分率呈显著正相关。虽然子囊孢子也可以通过伤口和衰老叶片侵染，但超过90％的病斑都来自花瓣介导的侵染。因此，子囊孢子侵染花瓣在油菜菌核病的侵染循环中起着非常重要的作用。
[0003]灰葡萄孢(Botrytis cinerea)也是一种世界性分别的重要植物病原真菌，寄主广泛，可引起1400多种植物的灰霉病，每年在全球造成10
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1000亿美元的经济损失。灰葡萄孢也是一种死体营养型病原真菌，主要是通过分生孢子从植物花器官侵入，引起植物花枯病、软腐病等。被侵染的花瓣凋落后接触到健康组织时，引起健康组织发病。灰葡萄孢可以从番茄花部侵染，导致花瓣枯萎，并在番茄果实等其他部位发病。灰葡萄孢在豌豆开花期间造成重大损失，侵染破坏14.7
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19.4％的花，使豌豆减产。花序营养充足，花粉和花蜜含有蛋白质、糖类、矿物质和氨基酸等能促进灰葡萄孢分生孢子萌发。灰葡萄孢容易利用花序营养从花部侵染导致组织坏死，在坏死部位产生大量的分生孢子，继续再侵染。
[0004]由于核盘菌和灰葡萄孢都是死体营养型病原真菌，生产上缺乏菌核病和灰霉病的抗性品种。目前防治作物菌核病和灰霉病主要依赖于化学防治。但是化学农药的长期使用(尤其是滥用)，易产生抗药性、农药残留和环境污染等问题。随着基因技术的发展，培育抗病转基因材料越来越受到重视。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于利用花瓣在核盘菌和灰霉菌侵染植物中的特殊作用创制抗菌核病和灰霉病的转基因材料。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]在专利技术人的前期研究中发现基因CmYC1在体外表达的蛋白酶有抑菌活性，基于此专利技术人在通过大量试验后，提供了一种制备抗花瓣侵染病害转基因材料的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1：构建花瓣特异性表达载体，该花瓣特异性表达载体包含花瓣特异性启动子和目的基因CmYC1，其中目的基因CmYC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0009]步骤2：将花瓣特异性表达载体转化至农杆菌，再通过农杆菌转化子介导受体植物转化。
[0010]在上述技术方案中，花瓣侵染病害可以为菌核病和/或灰霉病。经实验验证，通过上述方法创制的转基因植物具有抗菌核病和灰霉病的能力，能有效抑制核盘菌和灰霉菌对花瓣的浸染，进而阻断其对植株茎叶等组织的侵染。
[0011]优选地，在某一具体的实施案例中，花瓣特异性启动子具体为油菜花瓣特异性启动子XY355且其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]优选地，在某一具体的实施案例中，花瓣特异性表达载体的基础载体为载体PC2300，该载体中含有35S强启动子表达GUS基因，可用于检测重组载体是否在受体植物中表达。在上述技术方案中，受体植物优选为拟南芥或油菜。
[0013]更进一步地，当受体植物为拟南芥时，转化过程具体为：待拟南芥抽薹开花且出现成熟角果后，将已经长出的角果和已经授粉的花剪掉，并用农杆菌菌液浸湿花蕾，培养后收集种子，待种子长成后筛选获得转基因植株。
[0014]更进一步地，当受体植物为油菜时，转化过程具体为：切取油菜幼苗的下胚轴，用农杆菌菌液侵染后，培养获得转基因植株。
[0015]本专利技术的有益效果为：本专利技术以花瓣特异性启动子构建了CmYC1的表达载体，采用农杆菌转化技术，成功创制了花瓣特异表达CmYC1的抗菌核病油菜和拟南芥转基因材料，所得转基因材料能有效抑制花瓣介导的核盘菌和灰霉菌侵染，也为其它花瓣侵染病害的防控提供了参考。
附图说明
[0016]图1为实施例1构建的花瓣特异性表达载体PC2301
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XY355
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CmYC1的结构示意图；
[0017]图2为实施例2制备的拟南芥转基因材料的表型图；
[0018]图3为实施例2制备的拟南芥转基因材料的PCR鉴定结果图；
[0019]图4为实施例2制备的拟南芥转基因材料的花瓣RT
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PCR鉴定结果图；
[0020]图5为实施例2制备的拟南芥转基因材料的花瓣的抗菌核病测试结果图；
[0021]图6为实施例3制备的油菜转基因材料的表型图；
[0022]图7为实施例3制备的油菜转基因材料的PCR鉴定结果图；
[0023]图8为实施例3制备的油菜转基因材料的花瓣RT
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PCR鉴定结果图；
[0024]图9为实施例3制备的油菜转基因材料的western blot检测结果图；
[0025]图10为实施例3制备的油菜转基因材料的花瓣的抗菌核病测试结果图；
[0026]图11为实施例3制备的油菜转基因材料的花瓣的抗灰霉病测试结果图。
具体实施方式
[0027]下面将结合实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。
[0028]下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0029]实施例1
[0030]本实施例构建了一种包含油菜花瓣特异性启动子XY355和目的基因CmYC1的重组表达载体，制备方法具体为：
[0031]以核盘菌菌核诱导的盾壳霉(Coniothyrium minitans)cDNA为模板，扩增得到序列如SEQ ID NO.1所示的目的基因CmYC1片段；并以载体PC2300作为基础载体，使用SmaⅠ/BamHⅠ双酶切法将启动子XY355片段(序列如SEQ ID NO.2所示)和如SEQ ID NO.1所示的扩增产物片段连本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备抗花瓣侵染病害转基因材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：构建花瓣特异性表达载体，所述花瓣特异性表达载体包含花瓣特异性启动子和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的目的基因CmYC1；步骤2：将花瓣特异性表达载体转化至农杆菌，再通过农杆菌转化子介导受体植物转化。2.根据权利要求1所述制备抗花瓣侵染病害转基因材料的方法，其特征在于，所述花瓣侵染病害为菌核病或灰霉病。3.根据权利要求1所述制备抗花瓣侵染病害转基因材料的方法，其特征在于，所述花瓣特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO....

【专利技术属性】
技术研发人员：杨龙，王永春，李国庆，吴明德，张静，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：