一种无血清培养基及其制备方法技术

本发明专利技术属于细胞培养基技术领域，涉及一种无血清培养基及其制备方法。该无血清培养基包括：无血清基础培养基、牛血小板裂解液、支链氨基酸和牛胰岛素。本发明专利技术采用牛血小板浓缩物和蛋白质生物活性稳定剂制得牛血小板裂解液，配合支链氨基酸和牛胰岛素用于替代胎牛血清。牛血小板浓缩物以牛外周血为原料，具有无需杀害动物、稳定的货源供应、高性价比以及更高的批次稳定性等优点。本发明专利技术提供的培养基能够有效地诱导牛骨骼肌卫星细胞分化为成肌细胞，并融合形成肌管，诱导效率高，并具有成分明确、成本低、微生物污染低的优点。微生物污染低的优点。微生物污染低的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种无血清培养基及其制备方法


[0001]本专利技术属于细胞培养基
，涉及一种无血清培养基及其制备方法。

技术介绍

[0002]细胞培养肉是通过在动物体外进行细胞培养，利用合成生物学、再生医学和组织工程学等相关技术使细胞分化为肌管形成类似肌肉的组织，再经过产品化加工直接生产获得的肉制品。与传统肉类生产方式相比，培养肉可以降低30％～50％的能源消耗，降低70％～90％的温室气体排放量和90％以上的土地使用。同时，细胞培养肉在一个相对可控的环境中生产，能够有效避免病原微生物的污染和抗生素的使用。发展细胞培养肉技术，可以高效和可持续地为人类提供充足、健康的肉制品。
[0003]虽然细胞培养肉有许多优点，但是目前这个行业尚在发展的早期，绝大多数技术都还处于实验室研究阶段，行业本身仍然面临众多的挑战。首先，培养基成本过高是细胞培养肉实现商业化的最大挑战，细胞培养肉想要达到天然肉类的口感和风味，需要将体外培养的细胞分化成肌细胞，并且融合形成肌管，现有的技术通常使用2％马血清进行诱导，然而诱导细胞分化成肌管的效率低下，使得细胞培养肉缺乏天然肉制品的纹理和口感。其次，血清的组成复杂，不同批次血清质量的稳定性难以控制，进而会影响工艺的稳定性，使用血清会使细胞培养肉的制作成本居高不下，增加商业化开发的难度。
[0004]血小板裂解物是直接将血液中血小板细胞富集后经过连续的反复冻融裂解制得。现阶段研究表明，血小板α颗粒含有丰富的趋化及生长因子，如血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子
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β(TGF
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β)、胰岛素样生长因子(IGF
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1)、基质细胞衍生因子
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1(SDF
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1)、血管内皮生长因子(VEGF)等，在制备成血小板裂解物的过程中会大量释放。
[0005]在细胞培养肉领域中，传统含有血清的培养基不符合保护动物和低碳的理念。此外，血清存在的批次间稳定性、产量和成本问题也制约了其在大规模生产中的应用。因此，开发能够高效诱导成肌分化的无血清培养基对细胞培养肉领域意义重大。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是寻求替代胎牛血清制备一种无血清培养基，解决血清存在的批次间稳定性、产量和成本问题。
[0007]基于上述目的，本专利技术提供了一种无血清培养基及其制备方法来满足本领域内的这种需要。
[0008]一方面，本专利技术涉及一种无血清培养基，包括无血清基础培养基，还包括：牛血小板裂解液、支链氨基酸和牛胰岛素。
[0009]进一步地，本专利技术提供的无血清培养基中，所述牛血小板裂解液的制备方法包括：从牛外周血中富集血小板，制得牛血小板浓缩物；
[0010]将所述牛血小板浓缩物与蛋白质生物活性稳定剂混合后，裂解得到所述牛血小板裂解液；所述蛋白质生物活性稳定剂包括：巯基保护剂、糖稳定剂和氨基酸稳定剂。
[0011]一般地，牛血小板浓缩物能通过富血小板血浆(PRP)技术或血沉棕黄层(BC)法从牛外周血中获得。
[0012]具体地，本专利技术提供了牛血小板浓缩物通过富血小板血浆(PRP)技术的制备方法，包括：将抗凝外周血在合适的离心力下(200G～1000G，10～60分钟)，将含有血小板的血浆混合物和红细胞(RBC)分离开，得到富血小板血浆(PRP)，进一步浓缩得到牛血小板浓缩物。
[0013]具体地，本专利技术提供了牛血小板浓缩物通过血沉棕黄层(BC)法的制备方法，包括：使用合适的离心力(500G～2000G，20～60分钟)，分离出最上层的无细胞血浆、称为血沉棕黄层(BC)的中间层和红血球(RBC)底层。取出BC层并混合少量血浆，得到牛血小板浓缩物。
[0014]进一步地，本专利技术提供的无血清培养基中，所述巯基保护剂选自：L
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半胱氨酸、L
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半胱氨酸盐酸盐、谷胱甘肽中的至少一种；所述糖稳定剂选自：葡萄糖、海藻糖中的至少一种；所述氨基酸稳定剂选自：脯氨酸、脯氨酸盐中的至少一种；
[0015]所述蛋白质生物活性稳定剂的用量为：3～20mmol/L的所述巯基保护剂、150～600mmol/L的所述糖稳定剂和12～150mmol/L的所述氨基酸稳定剂。本专利技术在牛血小板裂解液的制备中，加入了特定组分与一定比例的蛋白质生物活性稳定剂，用于保护牛血小板裂解过程中的活性成分。
[0016]进一步地，本专利技术提供的无血清培养基中，所述牛血小板裂解液的制备还包括肝素或其盐，以质量百分比计，所述肝素或其盐的用量为0.3％～1％。本专利技术在牛血小板裂解液的制备中，加入了一定比例的肝素或其盐，用于避免牛血小板粘附和团聚，进而使得牛血小板充分裂解。
[0017]进一步地，本专利技术提供的无血清培养基中，以质量百分比计，所述牛血小板裂解液的浓度为1％～10％。
[0018]进一步地，本专利技术提供的无血清培养基中，所述支链氨基酸的用量为：100～500mg/L亮氨酸、50～300mg/L缬氨酸和50～300mg/L异亮氨酸。
[0019]进一步地，本专利技术提供的无血清培养基中，包括：10nM～500nM所述牛胰岛素。
[0020]本专利技术对无血清基础培养基的类型不做特别限定，示例性地，所述无血清基础培养基选自DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12、M199或L15中的一种或以其为基础的改良培养基。
[0021]本领域内技术人员易知，在动物体外进行细胞培养，根据细胞来源物种的不同，通常会采用不同的无血清基础培养基。
[0022]以牛骨骼肌卫星细胞为例，选用DMEM为无血清基础培养基，本专利技术提供了一种促进牛骨骼肌卫星细胞分化的无血清培养基的制备方法，其包括：分离牛外周血的血小板，得到牛血小板浓缩物；
[0023]将所述牛血小板浓缩物和蛋白质生物活性稳定剂混合后，加入肝素或其盐，通过冷冻/融化循环法或超声法制得血小板裂解液；所述蛋白质生物活性稳定剂的用量为：3～20mmol/L的巯基保护剂、150～600mmol/L的糖稳定剂和12～150mmol/L的氨基酸稳定剂；所述巯基保护剂选自：L
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半胱氨酸、L
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半胱氨酸盐酸盐、谷胱甘肽中的至少一种；所述糖稳定剂选自：葡萄糖、海藻糖中的至少一种；所述氨基酸稳定剂选自：脯氨酸、脯氨酸盐中的至少一种；以质量百分比计，所述肝素或其盐的用量为0.3％～1％；
[0024]以无血清基础培养基为基础，混入所述牛血小板裂解液、支链氨基酸和牛胰岛素；
[0025]所述无血清基础培养基为DMEM；以质量百分比计，所述牛血小板裂解液的浓度为1％～10％；所述支链氨基酸的用量为：100～500mg/L亮氨酸、50～300mg/L缬氨酸和50～300mg/L异亮氨酸；所述牛胰岛素的用量为10nM～500nM。
[0026]具体地，本专利技术提供的促进牛骨骼肌卫星细胞分化的无血清培养基的制备方法中，所述冷冻/融化循环法为：经历至少3次以上的冷冻/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无血清培养基，包括无血清基础培养基，其特征在于，还包括：牛血小板裂解液、支链氨基酸和牛胰岛素。2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述牛血小板裂解液的制备方法包括：从牛外周血中富集血小板，制得牛血小板浓缩物；将所述牛血小板浓缩物与蛋白质生物活性稳定剂混合后，裂解得到所述牛血小板裂解液；所述蛋白质生物活性稳定剂包括：巯基保护剂、糖稳定剂和氨基酸稳定剂。3.根据权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于，所述巯基保护剂选自：L
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半胱氨酸、L
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半胱氨酸盐酸盐、谷胱甘肽中的至少一种；所述糖稳定剂选自：葡萄糖、海藻糖中的至少一种；所述氨基酸稳定剂选自：脯氨酸、脯氨酸盐中的至少一种；所述蛋白质生物活性稳定剂的用量为：3～20mmol/L的所述巯基保护剂、150～600mmol/L的所述糖稳定剂和12～150mmol/L的所述氨基酸稳定剂。4.根据权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于，所述牛血小板裂解液的制备还包括肝素或其盐，以质量百分比计，所述肝素或其盐的用量为0.3％～1％。5.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，以质量百分比计，所述牛血小板裂解液的浓度为1％～10％。6.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述支链氨基酸的用量为：100～500mg/L亮氨酸、50～300mg/L缬氨酸和50～300mg/L异亮氨酸。7.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，包括：10nM～500nM所述牛胰...

【专利技术属性】
技术研发人员：周凤，屈亚平，包立辉，
申请(专利权)人：陕西未来肉膳健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：