一种清除衰老间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术具体公开了一种清除衰老间充质干细胞的方法。其主要包括以下步骤：细胞培养：取间充质干细胞，使用完全培养基进行常规培养及正常传代；预处理：当正常传代后的间充质干细胞密度长至50～60％时，在完全培养基中，加入20nM浓度的白藜芦醇，继续培养；三梯度分离液制作：使用分离液原液和生理盐水按1:5.667、1:3.156的体积比分别配置成密度为1.048g/ml、1.077g/ml的分离液，使用分离液原液和完全培养基按1:4.079的体积比配置成密度为1.063g/ml的分离液；密度梯度离心及细胞收集：依次将密度为1.077g/ml、1.063g/ml、1.048g/ml的分离液加入离心管中，并将预处理后的间充质干细胞的细胞悬液加入离心管中的分离液最上层，进行离心，至分离液中明显获得3种不同密度的细胞；清除衰老间充质干细胞。清除衰老间充质干细胞。清除衰老间充质干细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种清除衰老间充质干细胞的方法


[0001]本专利技术属于医药学领域，具体涉及一种清除衰老间充质干细胞的方法。

技术介绍

[0002]白藜芦醇是一种多酚类化合物，广泛存在于葡萄皮、红酒、花生以及多种药用植物中，亦可经过化学合成甚至加工修饰获得稳定的具有生物活性的产物，其生物学效应非常广泛，包括抗肿瘤、抗衰老、抗炎、抗氧化、保护心血管、调节免疫等多种作用，且无明显细胞毒性作用。
[0003]间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一种来源广泛的成体干细胞，几乎存在于所有结缔组织中，目前已报道的组织来源包括脐带、羊膜、羊水、胎盘、骨髓、血液、脂肪和牙髓等，具有高度自我更新和多向分化潜能，以及造血支持、免疫调节、组织修复等多重作用。MSC可以分化成多种体细胞，并可转移到受损组织中，发挥促进组织再生，减少炎症以及抑制衰老等多重作用。在国内市场中，已经有24款间充质干细胞新药获得临床批件，在临床应用及产业化中，间充质干细胞均展示出广阔的应用前景。
[0004]由于间充质干细胞是一种成体干细胞，分裂能力比较有限，一般经过5至10代的体外培养扩增后，衰老细胞的比例会大幅增加，已有大量研究表明，衰老细胞会通过衰老相关分泌表型(senescence
‑
associated secretory phenotype,SASP)，过度释放IL
‑
6、IL
‑
8、IFN
‑
γ及MCP
‑
1等炎症因子，促进机体炎症水平上调，另外，衰老细胞还能通过旁分泌，加速周围细胞的老化，因此，输注入人体的衰老MSC过多，可能会影响其治疗效果。而另一方面，随着间充质干细胞产业化的快速发展，对其数量需求急剧增加，因此，在间充质干细胞的新药研发及未来的应用过程中，不可避免的对其进行大批量的体外培养及传代扩增，这就导致实际使用的间充质干细胞产品中会存在一定的衰老细胞，当衰老细胞的比例达到一定数量，就会影响间充质干细胞的临床治疗效果。因此，若能有效清除衰老间充质干细胞，将有可能提高MSC制剂的稳定性，促进其产业化快速发展。由于缺乏无创性的衰老细胞检测手段，目前，清除衰老MSC的方法仍然比较局限，可见，找到一种合适的物质清除MSC中的衰老细胞的方法尤为重要。
[0005]本专利技术就是基于这种情况作出的。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于：提供一种清除衰老间充质干细胞的方法，即在完全培养基中加入特定浓度的白藜芦醇对间充质干细胞进行细胞培养，并加入几种不同密度的分离液进行离心分离，从而分离出衰老的间充质干细胞，使得间充质干细胞中衰老细胞比例显著降低。
[0007]一种清除衰老间充质干细胞的方法，具体包括如下步骤：
[0008](1)细胞培养：取间充质干细胞，使用完全培养基进行常规培养，当细胞生长至80％密度时，按1传3的比例进行正常传代；
[0009](2)预处理：当正常传代后的间充质干细胞密度长至50～60％时，在完全培养基中，加入20nM浓度的白藜芦醇，继续培养24小时；
[0010](3)三梯度分离液制作：使用分离液原液和生理盐水按1:5.667、1:3.156的体积比分别配置成密度为1.048g/ml、1.077g/ml的分离液，使用分离液原液和完全培养基按1:4.079的体积比配置成密度为1.063g/ml的分离液；
[0011](4)密度梯度离心及细胞收集：依次将密度为1.077g/ml、1.063g/ml、1.048g/ml的分离液加入离心管中，并将步骤(2)处理后的间充质干细胞的细胞悬液加入离心管中的分离液最上层，进行离心，至分离液中明显获得3种不同密度的细胞；
[0012](5)清除衰老间充质干细胞：根据不同密度细胞在离心管中的位置将衰老细胞分离出来。
[0013]本专利技术所述间充质干细胞来源为人体脐带间充质干细胞。
[0014]本专利技术中，所述完全培养基为：F12、2％的血替以及2ng/ml的BFGF的混合，优选F12、2％的血替和2ng/ml的BFGF按体积比49000:1000:1混合。
[0015]所述F12的品牌为Hyclone；所述血替的品牌为Pall；所述BFGF的品牌为CHAMOT。
[0016]本专利技术中，所述分离液原液为OptiPrep
TM
，所述OptiPrep
TM
的密度为1.320
±
0.001g/mL。
[0017]本专利技术步骤(4)往离心管中加入分离液或加入步骤(2)处理后的间充质干细胞的细胞悬液时，均应沿离心管管壁将其缓慢加入到离心管中。
[0018]本专利技术步骤(4)进行离心时，按2500rpm，升速4，降速0的速度，离心20～30分钟。
[0019]本专利技术3种不同密度的细胞中，最高密度的多为死细胞及碎片，位于离心管最底部，中间密度的多为年轻细胞，位于1.063g/ml和1.077g/ml两种密度分离液之间，低密度的多为衰老细胞，位于1.048g/ml和1.063g/ml两种密度分离液之间。
[0020]本专利技术为了验证分离出的低密度细胞是否大部分为衰老细胞，主要采用衰老细胞检测的金标准X
‑
gal染色及衰老相关基因检测。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0022]本专利技术通过利用特定浓度的白藜芦醇分离并清除衰老的间充质干细胞，且不影响年轻间充质干细胞，使得间充质干细胞中衰老细胞比例显著降低。经白藜芦醇处理后的间充质干细胞标本，其对T细胞炎症因子及增殖的抑制实验检测时，间充质干细胞的增殖速度显著增加，免疫调节能力也大幅提升。
附图说明
[0023]图1为实施例1中清除衰老间充质干细胞的流程图；
[0024]图2a为实施例3中四组细胞中X
‑
gal阳性细胞的分布图；
[0025]图2b为实施例3中四组细胞中X
‑
gal阳性细胞的比例；
[0026]图3为实施例4未分离MSC、低密度MSC及高密度MSC的细胞中衰老相关基因相对表达量的检测图。
具体实施方式
[0027]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。
[0028]本专利技术中白藜芦醇可通过商业途径购买获得。
[0029]实施例1
[0030]一种清除衰老间充质干细胞的方法，具体包括如下步骤：
[0031](1)细胞培养：
[0032]脐带来源：选择自愿捐赠的健康产妇，进行充分沟通，并告知脐带用途，签署《脐带血及脐带捐赠知情同意书》，由临床医生在生产时选择合适的时机分离出脐带，放置于脐带保存液中，并在3h内通过2～8℃低温运输至实验室进行分离培养。
[0033]原代细胞提取及培养：采取组织贴壁法，提取原代间充质干细胞，通过形态，细胞表型及分化能力对细胞进行鉴定，并对细胞进行细菌、病毒及支本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种清除衰老间充质干细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)细胞培养：取间充质干细胞，使用完全培养基进行常规培养，当细胞生长至80％密度时，按1传3的比例进行正常传代；(2)预处理：当正常传代后的间充质干细胞密度长至50～60％时，在完全培养基中，加入20nM浓度的白藜芦醇，继续培养24小时；(3)三梯度分离液制作：使用分离液原液和生理盐水按1:5.667、1:3.156的体积比分别配置成密度为1.048g/ml、1.077g/ml的分离液，使用分离液原液和完全培养基按1:4.079的体积比配置成密度为1.063g/ml的分离液；(4)密度梯度离心及细胞收集：依次将密度为1.077g/ml、1.063g/ml、1.048g/ml的分离液加入离心管中，并将步骤(2)处理后的间充质干细胞的细胞悬液加入离心管中的分离液最上层，进行离心，至分离液中明显获得3种不同密度的细胞；(5)清除衰老间充质干细胞：根据不同密度细胞在离心管中的位置将衰老细胞分离出来。2.根据权利要求1所述的清除衰老间充质干细胞的方法，其特征在于所述间充质干细胞来源为人体...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡闯，季明芳，李付贵，
申请(专利权)人：中山市人民医院，
类型：发明
国别省市：