一种甲基营养菌来源的乙醇脱氢酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于甲基营养菌Methylopilasp.M107的乙醇脱氢酶及其编码基因与应用，利用TwistBiosciences方法合成乙醇脱氢酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，具有广泛的底物特异性且对于乙醇的活性最高。本发明专利技术获得的乙醇脱氢酶基因可克隆到合适的宿主中实现表达，实现工业化生产乙醇脱氢酶，为后续的工业应用提供成本低廉的乙醇脱氢酶原始材料。该酶在疾病诊断、临床治疗、生命体的代谢机理研究、酒精浓度的计算、生物传感器的制备以及化学合成等化工领域应用广泛，具有重要的经济和社会价值。具有重要的经济和社会价值。具有重要的经济和社会价值。

【技术实现步骤摘要】
一种甲基营养菌来源的乙醇脱氢酶及其编码基因与应用


[0001]本专利技术涉及一种乙醇脱氢酶，具体涉及一种甲基营养菌来源的乙醇脱氢酶及其编码基因与应用。属于基因工程


技术介绍

[0002]乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase，ADH)，系统名为乙醇辅酶I氧化还原酶，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性。乙醇脱氢酶能够以氧化型辅酶Ⅰ、氧化型辅酶Ⅱ、吡咯喹啉琨为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应。乙醇脱氢酶的种类繁多，广泛分布于所有生命体内，由于不同生命体生存的环境不同，导致不同来源的乙醇脱氢酶理化特征、生理功能各不相同。乙醇脱氢酶在疾病诊断、临床治疗、生命体的代谢机理研究、酒精浓度的计算、生物传感器的制备以及化学合成等化工领域应用广泛。
[0003]乙醇脱氢酶分布广泛，大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中。而微生物种类繁多，并且可再生能力极强。因此，从微生物中提取纯化乙醇脱氢酶，将是实现乙醇脱氢酶大规模生产的一条重要途径。对于微生物中的乙醇脱氢酶，目前研究较为详细的是一些嗜温细菌的吡咯喹啉琨(PQQ)依赖性的乙醇脱氢酶。甲基营养菌来源的乙醇脱氢酶研究较少，而其对于环境保护、化工生产及工业应用方面都有很重要的意义，因此，从甲基营养菌中筛选出独具特性的乙醇脱氢酶将成为开发新型工业酶制剂的一个重要方向。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种甲基营养菌来源的乙醇脱氢酶及其编码基因与应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0006]1、乙醇脱氢酶的编码基因，所述基因具有以下任意一种核苷酸序列：
[0007](1)与SEQ ID NO.1所示序列一致；
[0008](2)对SEQ ID NO.1所示序列进行取代、添加和/或缺失一个或两个以上核苷酸但能获得编码保留乙醇脱氢酶蛋白生物学特性的突变基因。
[0009]优选的，所述突变基因至少与SEQ ID NO.1所示序列具有90％以上的同源性。
[0010]进一步优选的，所述突变基因至少与SEQ ID NO.1所示序列具有95％以上的同源性。
[0011]更进一步优选的，所述突变基因至少与SEQ ID NO.1所示序列具有99％以上的同源性。
[0012]2、携带上述编码基因的载体。
[0013]3、利用上述载体转化或转染原核生物或真核生物宿主。
[0014]优选的，宿主包括细菌、真菌或哺乳动物细胞。
[0015]进一步优选的，宿主为大肠杆菌或工程菌MethylobacteriumextorquensAM1。
[0016]更进一步优选的，宿主为工程菌MethylobacteriumextorquensAM1。
[0017]4、经上述编码基因表达得到的乙醇脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或者对SEQ ID NO.2所示的序列，远离活性位点E95(95位谷氨酸)、W274(274位色氨酸)、D346(346位天冬氨酸残基)位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有乙醇脱氢酶活性的衍生蛋白质。
[0018]优选的，所述衍生蛋白质至少与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有90％以上的同源性。
[0019]进一步优选的，所述衍生蛋白质至少与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有95％以上的同源性。
[0020]更进一步优选的，所述衍生蛋白质至少与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有99％以上的同源性。
[0021]5、上述乙醇脱氢酶、载体或宿主在催化醇类或醛类水解中的应用。
[0022]优选的，所述的醇类或者醛类包括甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、异丙醇、甲醛和乙醛。
[0023]进一步优选的，所述乙醇脱氢酶、载体或宿主在催化乙醇水解中的应用。
[0024]本专利技术的有益效果：
[0025]本专利技术涉及一种来源于甲基营养菌Methylopilasp.M107的乙醇脱氢酶及其编码基因与应用，利用TwistBiosciences方法合成乙醇脱氢酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，具有广泛的底物特异性且对于乙醇的活性最高。本专利技术获得的乙醇脱氢酶基因可克隆到合适的宿主中实现表达，实现工业化生产乙醇脱氢酶，为后续的工业应用提供成本低廉的乙醇脱氢酶原始材料。该酶在疾病诊断、临床治疗、生命体的代谢机理研究、酒精浓度的计算、生物传感器的制备以及化学合成等化工领域应用广泛，具有重要的经济和社会价值。
[0026]本专利技术通过特异性底物(乙醇)筛选获得一种新的乙醇脱氢酶基因，经PCR、酶切、同源重组和测序，乙醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。乙醇脱氢酶基因大小为1896bp，碱基组成为：374A(19.73％)、278T(14.66％)、642C(33.86％)和602G(31.75％)，编码蛋白含631个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，获得的乙醇脱氢酶可以水解多种醇类和醛类，当底物为乙醇时催化活性最高，酶活Vmax为0.7214U/mg，米氏常数K
m
为0.02773mM。
[0027]该乙醇脱氢酶在pH7.5
‑
pH9.0条件下，能够保持80％以上的活性。此外，在添加大部分金属离子的反应体系中仍保持活性，特别是在K
+
、Ca
2+
条件下，酶学活性增大。而且，在低浓度有机溶剂中也存在活性。该乙醇脱氢酶能水解多种醇类和醛类，并且对于乙醇的水解能力最强，且能稳定在微生物中被提取纯化，在疾病诊断、临床治疗、生命体的代谢机理研究、酒精浓度的计算、生物传感器的制备以及化学合成等化工领域应用广泛。
[0028]将该基因序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高的乙醇脱氢酶来源于Bacteria；Proteobacteria；Alphaproteobacteria；Hyphaproteobacteria；Hyphomicrobiales；Xanthobacteraceae；Starkeya；Starkeyanovella，相似性为93％(其在GenBank数据库中的注册号为PZQ12916.1)。系统发育分析结果表明，该乙醇脱氢酶属于PQQ依赖性醇脱氢酶家族。氨基酸多序列比对分析结果显示，该乙醇脱氢酶具有E95(95位谷氨酸),W274(274位色氨酸),D346(346位天冬氨酸残基)，组成的催化活性中心。综上所述，该
乙醇脱氢酶应为PQQ依赖性醇脱氢酶家族中的一名新成员。
[0029]在不影响乙醇脱氢酶蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO.2所示的活性中心氨基酸E95、W274、D346等进行各种氨基酸替换、增添和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有乙醇脱氢酶活性的衍生蛋白质。一般来说，蛋白质的生物学活性和其功能结构域密切相关的。只有发生在功能结构本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.乙醇脱氢酶的编码基因，其特征在于，所述基因具有以下任意一种核苷酸序列：(1)与SEQ ID NO.1所示序列一致；(2)对SEQ ID NO.1所示序列进行取代、添加和/或缺失一个或两个以上核苷酸但能获得编码保留乙醇脱氢酶蛋白生物学特性的突变基因。2.携带权利要求1所述编码基因的载体。3.利用权利要求2所述载体转化或转染原核生物或真核生物宿主。4.根据权利要求3所述的宿主，其特征在于，宿主包括细菌、真菌或哺乳动物细胞。5.经权利要求1所述编码基因表达得到的乙醇脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：余正，肖颖，黄静，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：