一种虾过敏原混合物的制备方法技术

本发明专利技术提供一种虾过敏原混合物的制备方法。该制备方法包括以下步骤：(1)采用丙酮脱脂、风干、粉碎得到脱脂虾粉；(2)将脱脂虾粉和浸提液按照质量体积比为1g：(10mL～20mL)制备虾过敏原浸提液；(3)虾过敏原浸提液经透析、微滤得到虾过敏原纯化液；(4)将分别以北极甜虾、小白虾和南美白对虾为原料，按照步骤(1)～(3)制备的北极甜虾过敏原纯化液、小白虾过敏原纯化液和南美白对虾过敏原纯化液按照体积比为1：(6～8)：(1.5～3)的比例混合，即得到虾过敏原混合物。本发明专利技术的虾过敏原混合物致敏组分更全面，具有较高生物学活性及阳性检出率，且本底干净，是更适合于我国虾过敏人群的高精度过敏原材料。敏原材料。

【技术实现步骤摘要】
一种虾过敏原混合物的制备方法


[0001]本专利技术属于抗体检测用原材料制备领域，具体涉及一种虾过敏原混合物的制备方法。

技术介绍

[0002]过敏性疾病已成为继心脑血管疾病、肿瘤、慢性呼吸疾病、糖尿病与代谢性疾病、精神心理疾病之后，又一威胁人类健康的重大慢性疾病。世界卫生组织发布的官方报告指出，22％～25％的全球人口曾经或正在遭受过敏性疾病的困扰，并且患病率在持续升高。我国过敏性疾病的调查显示：我国3000万哮喘患者中2/3为过敏性哮喘，18个主要城市中成人过敏性鼻炎的平均患病率达17.6％，儿童哮喘患病率在2019年达到7.57％，几乎每十年翻一番。
[0003]体外检测过敏原特异性抗体，进而确定过敏性疾病相关的过敏原的诊断形式是目前最安全、最可靠、最明确的检查方法，但目前过敏性疾病的体外诊断市场由国际厂商主导，其产品占据高端市场，价格十分昂贵。国产过敏性疾病诊断企业近年来快速发展，市场份额不断扩大，并逐渐向高端推进。虽然国产厂商的发展势头迅猛，但过敏性疾病诊断关键原材料始终依赖进口。
[0004]在易引起食物过敏的食物中，虾及其制品是非常重要的一类，联合国粮农组织相关研究部门将其列入八大类易致敏食品中。研究虾过敏原，必须首先获得高纯度的过敏原组分，而虾的品种很多，人群的过敏现象也具有地域性特征，进口虾过敏原原料与我国人民生活、饮食习惯的差异，对疾病的预防治疗带来风险。目前大量使用的进口虾过敏原适用性难以保证，易出现假阴性结果，造成漏检。进口虾过敏原原料价格高昂，增加了成本，同时供应的稳定性受国际形势影响存在巨大风险。而由于虾过敏原的致敏组分比较复杂，传统制备方法制备的虾过敏原属于粗提物，存在某些致敏组分未被该提取物包含在内导致的漏诊风险。
[0005]虾中主要过敏蛋白有原肌球蛋白(tropomyosin，TM)、精氨酸激酶(arginine kinase，AK)、肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)、肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium binding protein，SCP)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)和血蓝蛋白(hemocyanin)等。
[0006]因此，需要开发一种能够确保不同致敏组分的丰富度，并且保持较高的致敏原性的虾过敏原原料的制备方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种能够从虾中提取出更多更完整的致敏原蛋白的制备方法，使用该方法获得的虾过敏原致敏组分完整，致敏原性较高，能够直接用于体外检测试剂盒。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种虾过敏原混合物的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
[0010](1)采用丙酮脱脂、风干、粉碎得到脱脂虾粉；
[0011](2)将所述的脱脂虾粉和浸提液按照质量体积比为1g：(10mL～20mL)制备虾过敏原浸提液；
[0012](3)所述的虾过敏原浸提液经透析、微滤得到虾过敏原纯化液；
[0013](4)将分别以北极甜虾、小白虾和南美白对虾为原料，按照步骤(1)～(3)制备的北极甜虾过敏原纯化液、小白虾过敏原纯化液和南美白对虾过敏原纯化液按照体积比为1：(6～8)：(1.5～3)的比例混合，即得到所述的虾过敏原混合物。
[0014]优选地，步骤(4)中，所述的北极甜虾过敏原纯化液、小白虾过敏原纯化液和南美白对虾过敏原纯化液的体积比为1：7：2。
[0015]优选地，步骤(2)中，所述的浸提液为水或pH值为7.0～8.5的缓冲液。
[0016]进一步优选地，所述的缓冲液为浓度为0.01～0.02M的PBS缓冲液、浓度为0.01～0.02M的CBS缓冲液、浓度为0.04～0.06M的Tris
‑
HCl缓冲液、或含有KCl和DTT的浓度为0.04～0.06M的Tris
‑
HCl缓冲液。
[0017]再进一步优选地，所述的浸提液为含有0.1～0.3M KCl、0.4～0.8mM DTT的浓度为0.04～0.06M的Tris
‑
HCl缓冲液，所述的浸提液pH值为8.0～8.5。
[0018]优选地，步骤(2)中，所述的浸提液的制备方法为：将所述的脱脂虾粉和所述的浸提液混合后在2～6℃下静置1.5～2.5h，然后在离心力为8000～10000r/min的转速下离心15～25min，取上清，即为所述的浸提液。
[0019]优选地，步骤(3)中，采用截留分子量为3000～4000Da的透析袋、采用PBS低盐缓冲液作为透析液，所述的微滤采用的0.25～0.45μm滤膜过滤。
[0020]优选地，步骤(1)中，取虾的肌肉组织清与2～6℃冷丙酮按照1g：(8mL～12mL)混合过夜抽提，期间更换冷丙酮3
‑
4次，然后在3000～5000r/min的转速下离心10～20min，取沉淀，使用2～6℃冷丙酮洗涤沉淀至流出液无色，沉淀风干后粉碎得到所述的脱脂虾粉。
[0021]采用多工艺有机配合的精制策略，对不同品种的虾进行提取，然后经综合分析、优化复配，得到组分完整，阳性符合率更高的虾过敏混合物，从而提高过敏诊断的准确性，极大地降低致敏组分缺失与交叉反应带来的漏诊、误诊，使诊断结果更好的指导临床，明确相关过敏原，开展准确的免疫治疗。
[0022]本专利技术还提供一种虾过敏原混合物，所述的虾过敏原混合物由上述制备方法制备得到。
[0023]本专利技术还提供上述虾过敏原混合物在虾过敏检测试剂或检测试剂盒中的应用。
[0024]优选地，所述的检测试剂或检测试剂盒采用磁微粒化学发光技术。
[0025]本专利技术与现有技术相比具有如下优势：
[0026]本专利技术采用冻干品的形式，便于存放，并减少了因待检测样本被稀释导致的检测结果偏低的问题。
[0027]本专利技术的制备方法制备的虾过敏原混合物致敏组分更全面，具有较高生物学活性及阳性检出率，且本底干净，对我国虾过敏患者的血清检测结果准确性更高，漏检风险更低，是更适合于我国虾过敏人群的高精度过敏原材料。
附图说明
[0028]图1为根据BSA标准品测值获得的标准曲线；
[0029]图2为实施例1～6中制备的过敏原溶液的SDS
‑
PAGE电泳图；
[0030]图3为北极甜虾过敏原纯化液、小白虾过敏原纯化液和南美白对虾过敏原纯化液的SDS
‑
PAGE电泳图；
[0031]图4为临床人阳性血清免疫印迹实验检测结果图；
[0032]图5为临床人阴性血清免疫印迹实验检测结果图。
具体实施方式
[0033]下面结合实施例对本专利技术作进一步描述。但本专利技术并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种虾过敏原混合物的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：(1)采用丙酮脱脂、风干、粉碎得到脱脂虾粉；(2)将所述的脱脂虾粉和浸提液按照质量体积比为1g：(10mL～20mL)制备虾过敏原浸提液；(3)所述的虾过敏原浸提液经透析、微滤得到虾过敏原纯化液；(4)将分别以北极甜虾、小白虾和南美白对虾为原料，按照步骤(1)～(3)制备的北极甜虾过敏原纯化液、小白虾过敏原纯化液和南美白对虾过敏原纯化液按照体积比为1：(6～8)：(1.5～3)的比例混合，即得到所述的虾过敏原混合物。2.根据权利要求1所述的虾过敏原混合物的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的北极甜虾过敏原纯化液、小白虾过敏原纯化液和南美白对虾过敏原纯化液的体积比为1：7：2。3.根据权利要求1所述的虾过敏原混合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的浸提液为水或pH值为7.0～8.5的缓冲液。4.根据权利要求3所述的虾过敏原混合物的制备方法，其特征在于：所述的缓冲液为浓度为0.01～0.02M的PBS缓冲液、浓度为0.01～0.02M的CBS缓冲液、浓度为0.04～0.06M的Tris
‑
HCl缓冲液、或含有KCl和DTT的浓度为0.04～0.06M的Tris
‑
HCl缓冲液。5.根据权利要求3所述的虾过敏原混合物的制备方法，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李思越，王惠荟，储家成，宋娟艳，孙国敬，李纪阳，
申请(专利权)人：江苏浩欧博生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：