结核分枝杆菌Ag85BDNA疫苗在制备调节小鼠肠道功能制剂中的应用制造技术

本发明专利技术涉及疫苗应用技术领域，具体公开了结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗在制备调节小鼠肠道功能制剂中的应用。本发明专利技术中结核分枝杆菌Ag85BDNA疫苗刺激肠粘膜产生SIgA抗体，还增加了厚壁菌门的相对丰富度，降低拟杆菌门的相对丰富度，增加了罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌的丰富度。富度。富度。

【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗在制备调节小鼠肠道功能制剂中的应用


[0001]本专利技术涉及疫苗应用
，具体涉及结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗在制备调节小鼠肠道功能制剂中的应用。

技术介绍

[0002]肠道微生物指动物肠道中存在的数量庞大的微生物，这群微生物依靠动物的肠道生活，同时帮助寄主完成多种生理生化功能。肠道不仅是人体消化吸收的重要场所，同时也是最大的免疫器官，在维持正常免疫防御功能中发挥着极其重要的作用。人体肠道为微生物提供了良好的栖息环境，具有人体自身不具备的代谢功能。
[0003]肠道微生物在系统发育地位上基本分属厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、梭杆菌门(Fusobacteria)6大门，其中拟杆菌门和厚壁菌门为主要优势菌群。
[0004]结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)感染所致的一种慢性传染病，是世界三大传染性疾病之一。卡介苗(BCG)是目前临床上唯一用于预防结核病的疫苗，也是预防结核病最有效的疫苗。由于不断传代，BCG的免疫保护效果逐渐削弱，同时，在BCG的制备过程中，一些与免疫记忆和保护相关的基因丢失，导致其保护期减短、保护性免疫应答减弱。所以，卡介苗对于新生儿有较好的免疫保护作用，对预防成人肺结核的作用却非常有限。因此加快研制更加安全、有效的新型疫苗刻不容缓。
[0005]结核病可能会造成肠道紊乱，而疫苗对肠道菌群平衡也有一定的要求，在预防和治疗结核病的时候调节肠道菌群至关重要，因此，对疫苗要求也逐渐升级。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗在制备调节肠道功能制剂中的应用，所述结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗刺激肠粘膜产生SIgA抗体，还增加了厚壁菌门的相对丰富度，降低肠道拟杆菌门的相对丰富度，增加了肠道罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌的丰富度。
[0007]本专利技术提供了结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗在制备调节肠道功能制剂中的应用，所述结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗能调节肠道菌群结构。
[0008]进一步地，所述Ag85B DNA疫苗的制备过程为：以pcDNA3.1+为真核表达载体，将信号肽基因和Rv1886c基因连接到pcDNA3.1+载体上，构建了真核表达质粒pcD
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Ag85B，即为结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗；
[0009]所述信号肽基因序列如SEQ ID NO.1所示；
[0010]所述85B蛋白的部分Rv1886c基因序列如SEQ ID NO.2所示；
[0011]合成得到的核苷酸链基因序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]进一步地，所述结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗增加了肠道菌群中厚壁菌门的相对丰富度，降低拟杆菌门的相对丰富度，增加了罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌的丰富度。
[0013]进一步地，所述结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗刺激机体产生了的体液免疫效应：刺激肠粘膜产生SIgA抗体，平均抗体效价为1:4500。
[0014]进一步地，所述pcD
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Ag85B重组质粒的免疫剂量为50μg/只。
[0015]进一步地，所述结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗能够用于制备预防和治疗肠道疾病的药物或者载体。
[0016]进一步地，所述结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗能够用于制备预防和治疗腹泻的药物或者载体。
[0017]进一步地，所述结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗能够用于制备预防和治疗消化不良的药物或者载体。
[0018]进一步地，所述结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗能够用于制备提高机体免疫力的药物。
[0019]进一步地，所述结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗能够用于制备预防和治疗结核病的药物；
[0020]所述药物同时具备调节肠道菌群平衡的功能。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0022]1、本专利技术运用分子生物学技术将信号肽基因和M.tb编码Ag85B的Rv1886c基因共963p核苷酸序列连接到pcDNA3.1+，构建真核表达质粒pcD
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Ag85B，即Ag85B DNA疫苗，真核表达质粒pcD
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Ag85B具有的高效扩增及整合稳定的优点。
[0023]2、本专利技术的Ag85B DNA疫苗经肌肉注射免疫C57BL/6J小鼠，发现该蛋白能有效诱导小鼠结肠粘膜产生体液免疫效应，且改善了结肠益生菌
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乳酸杆菌群，厚壁菌门
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乳杆菌属中的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)显著增长(p<0.05)；肠粘膜SlgA的效价为1：4500。
[0024]3、本专利技术构建的真核表达系统确保分泌蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面接近于天然蛋白分子。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]图1表示本专利技术中重组表达质粒pcD
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Ag85B的酶切鉴定电泳图，其中，M：15kb DNA marker；1：pcDNA3.1+；2：pcD
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Ag85B；3：pcD
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Ag85B digested products by HindⅢ/Xbal；
[0027]图2表示本专利技术中质粒转染CHO细胞后，Western blot检测细胞上清中Ag85B的表达情况，其中，M:Protein marker；1:CHO transfected with empty plasmid pcDNA3.1+；2:CHO transfected with pcD
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Ag85B；
[0028]图3表示本专利技术中Ag85B蛋白对肠粘膜SIgA(n＝4)抗体效价的影响；
[0029]图4表示本专利技术中小鼠肠道菌群多样性分析(n＝4)；
[0030]其中，图A为稀释曲线；图B为等级聚类曲线；图C为文氏图；D为香农多样性指数(Shannon指数)；图E为主成分分析图；图F为进化树；
[0031]图5表示本专利技术中各组小鼠结肠菌群物种组成及差异性分析；
[0032]其中，图A为Blank组和Ag85B组肠道微生物组成变化；
[0033]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗在制备调节肠道功能制剂中的应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗能调节肠道菌群结构。2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗在制备调节肠道功能制剂中的应用，其特征在于，所述Ag85B DNA疫苗的制备过程为：首先，将信号肽基因序列和Rv1886c部分基因序列合成核苷酸链，然后连接到pcDNA3.1+载体上，构建了真核表达质粒pcD
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Ag85B，即为结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗；所述信号肽基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述Rv1886c基因序列如SEQ ID NO.2所示；合成得到的核苷酸链基因序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗在制备调节肠道功能制剂中的应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗增加了肠道菌群中厚壁菌门的相对丰富度，降低拟杆菌门的相对丰富度，增加了罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌的丰富度。4.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗在制备调节肠道功能制剂中的应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗刺激机体产生了的体液免疫效应：刺激肠粘膜产生SIgA抗体，平均抗体效价为1:4500。5.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：万巧凤，杨雨欣，李慧，张炜，姚思，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：