用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物及其鉴定方法技术

本发明专利技术提供用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物及其鉴定方法，根据载体插入基因组的情况，在单拷贝株系中T

【技术实现步骤摘要】
用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物及其鉴定方法


[0001]本专利技术涉及植物转基因
，特别涉及用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物及其鉴定方法。

技术介绍

[0002]植物转基因技术在基因功能研究和分子育种领域发挥着重要作用。如何快速有效地从转基因后代中检测出纯合的植株，是鉴定目标基因效应的必需环节，也是转基因植物研究的重要环节。现有常规的的鉴定方法为先对转基因植株进行拷贝数的鉴定，找出单拷贝的株系，再通过PCR检测或qPCR技术，分析其T1代植株中的纯合体和杂合体；或者对T2代转基因苗的转入基因分离情况进行分析。
[0003]目前拷贝数的鉴定方法有两种：一种是直接通过后代植株携带转入基因的分离比例来推算T0代植株的拷贝数，一般阳性：阴性为3：1可以推测为单拷贝。此方法比较粗略，有时受到种子萌发率的影响，不够准确，而且需要一定的基数，耗费大量的后代转基因苗。另一种是采用Southern blot技术对转基因当代(T0代)植株进行鉴定，此方法比较准确，但费工费时，对DNA的提取质量、浓度、Southern blot实验技术有比较高的要求；而且Southern blot仅能鉴定出拷贝数，不能获知T
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DNA在植物基因组上的插入位置和旁侧序列。随着高通量测序的普及，全基因组测序的费用骤降，各种测序数据的分析平台也随之涌现，因此，通过全基因组测序及分析平台分析转基因株系的插入位点成为了更方便与精确的选择。基于全基因组测序下，寻找可用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物及其鉴定方法，对于植物转基因植株鉴定与研究提供重要的技术基础。

技术实现思路

[0004]鉴于此，本专利技术提出一种用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物及其鉴定方法。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]本专利技术提供一种用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物，根据载体插入基因组的情况，在单拷贝株系中T
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DNA插入位点的两侧侧翼序列分别设计跨插入位点的引物wing F/R，同时在T
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DNA区域设计一对引物mcherry F/R。
[0007]进一步说明，所述引物mcherry F/R的核苷酸序列如：SEQ ID NO.1
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2所示。
[0008]进一步说明，在单拷贝株系中T
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DNA插入位点的两侧侧翼500bp序列上设计跨插入位点的引物wing F/R。
[0009]进一步说明，根据M2单拷贝株系和M7单拷贝株系的不同载体插入基因组的情况，所述跨插入位点的引物wing F/R分别为引物M2 wing F/R和M7 wing F/R。
[0010]进一步说明，所述M2单拷贝株系的载体插入基因组的情况为：载体的RB
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LB区间插入基因组中的单拷贝转基因植物；所述M7单拷贝株系的载体插入基因组的情况为载体整个
序列都插入了基因组中的单拷贝转基因植物。
[0011]进一步说明，所述引物M2 wing F/R的核苷酸序列如：SEQ ID NO.3
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4所示；所述M7 wing F/R的核苷酸序列如：SEQ ID NO.5
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6所示。
[0012]一种水稻转基因后代纯合株系的鉴定方法，包括如下步骤：
[0013]步骤1：通过采用全基因组测序和CTREP
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finder平台分析，确定T0代转基因植物的T
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DNA插入的拷贝数、准确位置和侧翼序列；
[0014]步骤2：根据载体插入基因组的情况，在单拷贝株系中T
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DNA插入位点的两侧侧翼500bp序列上设计wing F/R引物对，同时联合在T
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DNA区域设计mcherry F/R引物对；
[0015]步骤3：采用步骤2获得的2对引物组合，对转基因后代不同基因型的基因组DNA进行一次PCR扩增，即可在T1代单株中鉴定获得纯合株系。
[0016]进一步说明，根据M2单拷贝株系的载体插入基因组的情况，所述引物组合为M2 wing F/R和mcherry F/R。
[0017]进一步说明，根据M7单拷贝株系的载体插入基因组的情况，所述引物组合为M7 wing F/R和mcherry F/R。
[0018]进一步说明，所述PCR扩增的程序为：95℃3min预变性；95℃，15s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃延伸7min；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0020]本专利技术通过采用了全基因组测序与CTREP
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finder平台分析，确定T0代转基因植物的T
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DNA插入的拷贝数、准确位置和侧翼序列的基础上，再根据插入位点的两侧侧翼序列设计获得跨插入位点的引物wing F/R，并在T
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DNA区域设计引物mcherry F/R，从而实现通过1次PCR扩增即可在T1代单株中快速精准地鉴定获得水稻转基因后代单拷贝纯合株系。本专利技术通过以M2和M7的2种单拷贝纯系的鉴定，筛选得到了最优的引物组合，实现T1后代中的野生型、杂合株系和纯合株系的快速精确地鉴别区分，结果清晰，纯系与杂合植株的PCR结果差异显著，无需分析计算或特殊仪器。
附图说明
[0021]图1为本专利技术表达载体pCUBi1390的图谱；
[0022]图2为本专利技术M2和M7两个株系的转基因载体在水稻基因组中的插入位点示意图；
[0023]图3为本专利技术不同引物组合对M2和M7两个株系的基因组DNA的PCR扩增示意图；其中，P1、P2为引物mcherry F和mcherry R，P3、P4为引物wing F和wing R；
[0024]图4为本专利技术采用不同引物组合对转基因后代不同基因型的基因组DNA进行PCR电泳检测的结果示意图；
[0025]图5为本专利技术M2和M7两个株系T1后代植株的PCR电泳检测结果示意图，其中，M2,M7代表2个UBI:mcherry的单拷贝株系后代；星号代表纯系植株；M:DNA Marker。
具体实施方式
[0026]为了更好理解本专利技术
技术实现思路
，下面提供具体实施例，对本专利技术做进一步的说明。
[0027]本专利技术实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028]本专利技术实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029]实施例1
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DNA提取及全基因组测序
[0030]取转基因T0代植株的叶片或T1后代群体的叶片混样(约0.2g组织)，用CTAB法提取基因组DNA。
[0031]以“锡稻1号”背景上的UBI:mcherry(表达载体为pCUBi1390)转基因植株为例。载本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物，其特征在于：根据载体插入基因组的情况，在单拷贝株系中T
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DNA插入位点的两侧侧翼序列分别设计跨插入位点的引物wing F/R，同时在T
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DNA区域设计一对引物mcherry F/R。2.如权利要求1所述的一种用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物，其特征在于：所述引物mcherry F/R的核苷酸序列如：SEQ ID NO.1
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2所示。3.如权利要求1所述的一种用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物，其特征在于：在单拷贝株系中T
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DNA插入位点的两侧侧翼500bp序列上设计跨插入位点的引物wing F/R。4.如权利要求3所述的一种用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物，其特征在于：根据M2单拷贝株系和M7单拷贝株系的不同载体插入基因组的情况，所述跨插入位点的引物wing F/R分别为引物M2 wing F/R和M7 wing F/R。5.如权利要求4所述的一种用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物，其特征在于：所述M2单拷贝株系的载体插入基因组的情况为：载体的RB
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LB区间插入基因组中的单拷贝转基因植物；所述M7单拷贝株系的载体插入基因组的情况为载体整个序列都插入了基因组中的单拷贝转基因植物。6.如权利要求4所述的一种用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物，其特征在于：所述引物M2 wing F/R的核苷酸序列如：SEQ ID NO.3

【专利技术属性】
技术研发人员：郭芾，舒庆尧，曾文卓，汪庆，钱秋，冯云艳，
申请(专利权)人：海南浙江大学研究院，
类型：发明
国别省市：