新型闭合线性双链DNA的体外制备技术制造技术

提供了一种制备闭合线性双链DNA的方法，包括：(a)提供一条含目标序列和至少两个限制性内切酶的酶切位点的双链DNA，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，(b)用限制性内切酶消化双链DNA，产生一条两端均具有非回文粘端的目标DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，(c)提供茎环DNA，其分别具有与目标DNA的粘端互补配对的粘端，其中所述茎环DNA的环状部分中的核苷酸是修饰的，(d)连接目标DNA和茎环DNA形成闭合线性双链DNA。链DNA。

【技术实现步骤摘要】
新型闭合线性双链DNA的体外制备技术


[0001]本专利技术属于核酸制备领域，特别涉及使用可产生非回文结构粘端的限制性内切酶体外高效制备一种稳定的新型闭合线性双链脱氧核糖核酸(DNA)的方法。

技术介绍

[0002]传统基于DNA的基因载体大多由各类微生物质粒改造而来，不可避免的含有与目的基因无关的微生物DNA序列和抗性基因序列。当这些产品被广泛使用时，这些序列就会进入宿主(如人)体内，或者通过平行基因转移整合进致病细菌或宿主的基因组，从而带来难以估计的潜在安全性问题。例如，传统DNA疫苗是以环状质粒在细菌(通常为大肠杆菌)中生长形式来构建，质粒中来自细菌的复制原点序列，原核启动子，原核抗生素基因序列等都会进入人体，可能通过平行基因转移整合到人和致病细菌的基因组，产生不可忽视的安全隐患，影响疫苗安全性。因而在生产DNA疫苗时，需要尽可能避免引入非抗原基因的其他附加序列。
[0003]这些多余的序列可以通过常规的酶切线性化后再纯化去除，但开环的线性化目标DNA的稳定性也会下降。也可以把开环的线性目标DNA再连接成两端闭合的DNA来增加稳定性，然而现有的常规酶切和连接技术由于会产生大量的连接副产物，实际获得目标闭合线性双链DNA的生产效率很低，分子量和带电量相似的目标DNA和副产物DNA也难以高效的分离纯化，很难实现放大的规模化工业生产。
[0004]最近几年，出现了一种生产不含细菌序列的DNA载体的技术，其中DNA只包含所需最小序列，包括抗原序列、启动子和polyA尾，这种新型DNA是DNA双链末端由磷酸二酯键连接闭合的线性DNA，被称为doggybone DNA(dbDNA)。与传统质粒DNA相比，dbDNA依赖于体外滚环复制的酶促反应，产生不含细菌序列的末端闭合线性双链DNA，末端的闭合性使之在细胞内较之开放末端的常规线性DNA更稳定，半衰期更长。然而，这种以滚环复制形式进行扩增的过程涉及体外聚合酶反应，大量的体外扩增反应很容易出现碱基错配或突变，从而引入新的安全性和产物一致性问题。对于长片段抗原序列，扩增过程需要的时间更长，这种不确定性的积累也会更明显。通过细菌制备传统质粒时，由于细菌内天然具有复杂的错配/突变修复系统，突变率远低于体外扩增反应。此外，质粒DNA在细菌中进行复制的过程中，DNA可以被甲基化和其他修饰，会进一步提高DNA的稳定性和表达效率。然而，这些修饰过程在体外滚环复制的扩增系统中也是不具备的，因而缺乏甲基化等修饰的dbDNA在DNA的稳定性及表达效率上也可能存在难以避免的短板。因此，本领域需要新的设计和方法来简便和快速的制备不含细菌序列的DNA载体。

技术实现思路

[0005]本专利技术设计了一种新型稳定的闭合线性双链DNA，命名为金箍棒DNA(Golden Cudgel DNA，缩写为GC
‑
DNA)，并涉及使用特定的可产生非回文结构粘端的限制性内切酶来制备GC
‑
DNA的方法。所述方法较之传统的酶切/连接方法具有更高效易行，产量高，副产物
少，更便于进行工业级放大和生产的优势。与dbDNA制备方法相比，所述GC
‑
DNA制备方法可以直接从常规质粒通过简单的步骤准确去掉来自细菌的多余序列，制备高纯度、质粒级别的低突变率、抗核酸酶、保留质粒上原有修饰且高稳定性的闭合线性双链DNA。
[0006]在一个方面，本专利技术提供了一种制备闭合线性双链DNA的方法，包括：
[0007](a)提供一条含目标序列和分别在目标序列两端的限制性内切酶的酶切位点的双链DNA(如质粒或PCR产物等)，其中所述限制性内切酶可在目标序列两端切割该双链DNA，产生两端均具有非回文结构的突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，
[0008](b)用所述限制性内切酶消化所述双链DNA，产生一条两端均具有非回文结构的突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，
[0009](c)提供茎环DNA，所述茎环DNA分别具有与所述线性目标双链DNA序列两端的非回文结构突出的粘端分别互补配对的突出的粘端，其中，所述茎环DNA的环状部分中的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的
[0010](d)连接(b)获得的线性目标双链DNA和(c)的茎环DNA以形成闭合线性双链DNA，优选在存在所述限制性内切酶的情况下进行连接，和
[0011](e)任选地，分离和/或纯化形成的闭合线性双链DNA，
[0012]其中，除在(a)的双链DNA中酶切位点中的识别序列外，所述目标序列、所述线性目标双链DNA、所述闭合线性双链DNA均不含有所述限制性内切酶的识别序列。
[0013]在一个方面，本专利技术提供了通过本专利技术所述方法获得或可获得的闭合线性双链DNA，其中在所述线性闭合双链DNA末端的环状部分中的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的。
[0014]在一个方面，本专利技术提供了一种质粒DNA，其包含给定序列或目标序列和在给定序列或目标序列两端具有限制性内切酶的酶切位点的双链DNA序列，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与给定序列或目标序列之间，其中所述限制性内切酶可在给定序列或目标序列两端切割该质粒DNA，产生两端均具有非回文结构的突出的粘端的线性双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对。优选地，所述质粒包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
[0015]本专利技术可在无细胞环境下生产闭合线性双链DNA，不仅可替代传统质粒DNA，而且可作为DNA药物进行体内表达基因产物，具有广泛的应用前景。同样，由于本专利技术生产的闭合线性双链DNA安全性高、稳定性好，且流程简单，是DNA疫苗中DNA来源的一个良好选择；另外，由于本专利技术生产的闭合线性双链DNA结构简单，且表达目的蛋白，可应用于基因编辑治疗或细胞治疗领域。
附图说明
[0016]图1：GC
‑
DNA生产流程示意图。
[0017]图2：质粒DNA图谱(A)及组成模式图(B)。实施例中制备GC
‑
DNA的质粒DNA是通过人工基因合成和亚克隆获得(安徽通用生物公司)，即在目标DNA序列两侧与细菌序列之间分
别添加一个BsmBI酶切位点而且这两个BsmBI酶切位点的序列是反向的。感兴趣的DNA序列包含启动子(CMV启动子)、报告基因(绿色荧光蛋白GFP(SEQ ID NO：3)的CDS区)及polyA尾。
[0018]图3：BsmBI酶切位点设计。A为BsmBI识别序列及切割位点。B为实施例中涉及的DNA接头序列，及酶切后产物模式图。C为连接体系中不同片段连接模式图，其中a为茎环接头与目的片段连接模式图，由本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备闭合线性双链DNA的方法，包括：(a)提供一条含目标序列和在目标序列两端的限制性内切酶的酶切位点的双链DNA，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，其中所述限制性内切酶切割该双链DNA时可产生两端均具有非回文突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，(b)用所述限制性内切酶消化所述双链DNA，产生一条两端均具有非回文突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，(c)提供茎环DNA，所述茎环DNA分别具有一个与所述线性目标双链DNA两端的粘端互补配对的突出的粘端，其中，所述茎环DNA的环状部分中的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的，(d)连接(b)获得的线性目标双链DNA和(c)的茎环DNA以形成闭合线性双链DNA，优选在存在所述限制性内切酶的情况下进行连接，和(e)任选地，分离和/或纯化形成的闭合线性双链DNA，其中，除在(a)的双链DNA中酶切位点中的识别序列外，所述目标序列、所述线性目标双链DNA、所述闭合线性双链DNA均不含有所述限制性内切酶的识别序列。2.权利要求1的方法，其中：
‑
(a)中的双链DNA的一条链上包含：第一限制性内切酶的识别序列
‑
第一限制性内切酶的切割位点
‑
目标序列
‑
第二限制性内切酶的切割位点的互补序列
‑
第二限制性内切酶的识别序列的互补序列，优选所述第一限制性内切酶和第二限制性内切酶是相同的，和/或
‑
所述线性目标双链DNA两端的粘端的序列是相同的，和/或
‑
所述线性目标双链DNA具有两个5
’
突出的粘端或两个3
’
突出的粘端，优选两个相同的5
’
突出的粘端或两个相同的3
’
突出的粘端。3.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)包括：(i)提供目标序列，提供一对引物，该对引物分别包含限制性内切酶的酶切位点序列及目标序列的上游或下游序列，以目标序列为模板进行扩增，从而产生所述线性目标双链DNA；或者(iii)提供目标序列，提供质粒DNA，该质粒DNA包含给定序列和分别位于给定序列两端的至少两个酶切位点，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，将所述目标序列克隆入所述质粒的所述至少两个酶切位点之间，从而产生所述线性目标双链DNA。4.权利要求1
‑
3任一项的方法，其中使用连接酶连接所述目标DNA和茎环DNA以形成闭合线性双链DNA，优选地，所述连接酶选自T4
‑
DNA连接酶、T3
‑
DNA连接酶、T7
‑
DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶和热稳定5
’
AppDNA连接酶。5.权利要求1
‑
4任一项的方法，其包括：(1)提供感兴趣的线性双链DNA，(2)提供质粒DNA，该质粒DNA包含给定序列和分别位于给定序列两端的至少两个酶切位点，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，优选所述至少两个酶切位点是相同的，
(3)将所述感兴趣的线性双链DNA克隆入所述质粒的所述至少两个酶切位点之间，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与感兴趣的线性双链DNA之间，(4)用分别识别所述酶切位点的限制性内切酶消化所述质粒，获得一条两端均具有非回文突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，(5)提供分别具有一个与所述线性目标双链DNA的粘端互补的突出的粘端的茎环DNA，其中，所述茎环DNA的环状部分中的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的，(6)优选在存在所述限制性内切酶的情况下，使用连接酶将步骤(4)中获得的线性目标双链DNA和步骤(5)中的茎环DNA连接以形成闭合线性双链DNA，和(7)任选地，分离和/或纯化形成的闭合线性双链DNA，优选地，其中一个酶切位点包含序列：CGTCTCN1N2N3N4N5(SEQ ID NO：11)，其中N1‑
N5独立地为脱氧核糖核苷酸A、T、C、G任一，条件是N2N3N4N5不是回文序列，优选N2‑
N5中至少3个或所有4个选自G和C，更优选地，一个酶切位点包含序列CGTCTCTCGGC，更优选地，所述质粒具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。6.权利要求1
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4任一项的方法，其包括：(1)提供感兴趣的线性双链DNA，(2)提供一对引物，该对引物分别包含限制性内切酶的酶切位点及感兴趣的DNA序列上游序列或下游序列，以感兴趣的线性双链DNA为模板，进行扩增，产生一条含感...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晟，唐传青，
申请(专利权)人：宜明苏州细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：