一种多功能小鲵皮肤肽tsin4及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多功能小鲵皮肤肽tsin4及其应用，所述小鲵皮肤肽tsin4采集秦巴巴鲵皮肤分泌物分离纯化获得，其氨基酸序列为Val Ala Phe Ile Gly His Cys Lys Gly Lys Thr Leu Arg Pro Lys Cys Phe。Tsin4具有较好的抑菌活性，可以抑制所测试的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，且MIC值较低；同时，tsin4具有良好的炎症调节活性，能够活化肥大细胞释放组胺和β

【技术实现步骤摘要】
一种多功能小鲵皮肤肽tsin4及其应用


[0001]本专利技术属于抗菌肽
，具体涉及一种多功能小鲵皮肤肽tsin4及其应用。

技术介绍

[0002]生物体在还未进化出现获得性免疫系统的20亿年中，原始的先天免疫系统构成了生物体最基本的防御体系。与获得性免疫相比，先天免疫具有免疫应答迅速及时、免疫对象非特异、免疫反应多样性等特点。抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)作为宿主抵御外界致病微生物侵袭的主要防御因子，是构成生物机体先天免疫系统的重要组成部分。抗菌肽由生物体特定基因编码，广泛存在于自然界原核生物和诸如植物、昆虫、两栖动物、哺乳动物之类的真核生物之中。
[0003]抗菌肽最早被发现是由于它所具有的抑菌功能，它的命名也由此而来。近年来抗生素的滥用给病原菌和环境微生物造成很大选择压力，诱导产生具有多种抗生素抗性的微生物菌株，给人类健康带来严重危机。抗菌肽分子量小、水溶性好、抗原性低、稳定性高，尤其具有不易产生耐药性的特点，故其有望成为未来治疗耐药性病原菌感染所引发疾病的理想药物。
[0004]两栖类由水生向陆生的过度是生物进化史上具有重大意义的事件，它使生物进化开始摆脱了水的束缚。在动物分类学中，两栖纲(Amphibian)分为有尾目(Urodela)、无尾目(Anura)和蚓螈目(Gymnophiona)，其中小鲵科动物被认为是亚洲特有的有尾两栖动物。秦巴北鲵(Ranodon tsinpaensis)最初在陕西周至被发现，后来进一步研究，目前更名为秦巴巴鲵(Liua tsinpaensis)，据报道分布于我国陕西、四川和河南。由于水陆两栖的特殊生境，两栖动物极易受到外界微生物的侵袭，因此在漫长的进化过程中产生了较为发达的先天免疫防御体系，抗菌肽是两栖动物先天免疫防御系统的重要组成部分。前人有研究报道蛙类、大鲵等均可以产生具有广谱的抑菌活性抗菌肽，但对小鲵科两栖动物抗菌肽的研究报道的较少。
[0005]目前，相对而言，对蛙类来源的多肽研究较为深入。蛙类不仅仅表达抗菌肽，不同蛙类会产生各种不同多肽，具有各种生物活性，包括抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、杀昆虫、抗氧化、抑制酶活、免疫调节、抗肿瘤等等。对有尾两栖的活性多肽研究大多集中于大鲵，报道较多的是抗菌肽，但也有的多肽具有其他生物活性。例如Cathelicidin
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ME1和Cathelicidin
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ME2抗菌肽(专利技术专利申请CN107759679A和CN107663234A)，除了具有抗菌活性，同时提高仔猪血液中白蛋白、抗体水平，并提高血液T淋巴细胞转化率、IL
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2含量。但是Cathelicidin
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ME1和Cathelicidin
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ME2的抗菌活性较弱，最小抑菌浓度(MIC)≥125μg/mL。专利技术专利CN106047968B报道了两条抗氧化多肽，可以增加小鼠血清中IgG水平、巨噬细胞及T细胞数量，但没有报道这两条多肽具有抗菌活性。同样还有专利技术专利申请CN111363773A改进处理方式后得到高F值的大鲵活性肽，实质是混合物。该活性肽对小鼠血清中IgG水平有所提高，同时具有抗氧化活性，但也没有报道抗菌活性。目前对小鲵抗菌肽的研究更少，专利技术专利申请CN102764273A报道了小鲵科的新疆北鲵来源的活性多肽，但仅报道了其具有抗
肿瘤活性。
[0006]肥大细胞属于白细胞中的粒细胞，细胞质中充满大小一致、染成蓝紫色的颗粒，这些颗粒主要由组胺、肝素、5
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羟色胺等物质组成，因具有介导炎症反应的活性也被称为炎症介质。肥大细胞主要分布于机体与外界环境相通的地方，如皮肤、气道和消化道等组织的血管周围，这些部位经常可以接触到病原体等环境异物，使肥大细胞成为造血
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免疫系统中首先与入侵病原体等异物相互作用的细胞群之一。肥大细胞接触刺激后脱颗粒(即释放细胞内的炎症介质)，使得周围的血管扩张，招募更多的免疫细胞、免疫因子达到感染或损伤区域，表现出炎症反应，清除异物抵抗感染。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种多功能小鲵皮肤肽，命名为tsin4，并为tsin4提供新的应用。
[0008]针对上述目的，本专利技术提供的多功能小鲵皮肤肽tsin4的氨基酸序列为Val Ala Phe Ile Gly His Cys Lys Gly Lys Thr Leu Arg Pro Lys Cys Phe。
[0009]上述小鲵皮肤肽tsin4的提取方法包括下述步骤：
[0010](1)用灭菌塑料刮板刮擦秦巴巴鲵背部，用含0.01mol/L EDTA的0.1mol/LNaCl水溶液冲洗秦巴巴鲵皮肤收集粘液；按体积比1：3～1：5将粘液与体积浓度为5％的乙酸水溶液混合均匀，4℃震荡过夜后离心取上清。用磷酸盐缓冲液调节上清液的pH至7.0～7.2后再次离心取上清，然后用超滤管截留分子量小于10000MW的组分，随后用0.45μm滤膜过滤，最后进行冷冻干燥。
[0011](2)将步骤(1)冷冻干燥的样品用0.1mol/L pH＝6.0的Na2HPO4‑
NaH2PO4缓冲液溶解后，上样至Sephadex G
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50凝胶过滤层析柱，用相同缓冲液洗脱得到3个洗脱峰溶液。
[0012](3)将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌平板划线，37℃培养过夜后，挑取单克隆至液体培养基，37℃、250r/min振荡培养4～6h，随后将培养物稀释至106cfu/mL，得到菌液。取菌液涂布平板后，将滤纸片分别浸入步骤(2)的洗脱峰溶液，将滤纸片贴在平板上，37℃培养过夜后观察是否产生透明的抑菌圈。
[0013](4)将步骤(2)中产生透明抑菌圈的洗脱峰溶液冷冻干燥后上样至Sephadex G
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25凝胶过滤层析柱，同步骤(2)的方法进行洗脱，得到3个洗脱峰溶液，按照步骤(3)的方法检测获得的3个洗脱峰溶液的抑菌活性。
[0014](5)将步骤(4)中获得的具有抑菌活性的洗脱峰溶液冷冻干燥后用质量浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液溶解，上样至Hypersil BDS C18反相半制备色谱柱，流动相A为质量浓度为0.05％的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，洗脱梯度为：100％A液0～3min，100％～20％A液3～35min，20％A液35～40min；柱流速为4mL/min。回收的主峰样品进行冷冻干燥。
[0015](6)将步骤(5)冷冻干燥的主峰样品溶解于质量浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液，上样至液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪，质谱检测后进行数据分析，得到一条分子量1905.35Da的多肽，命名为tsin4，共计17个氨基酸，其氨基酸序列为Val Ala Phe Ile Gly His Cys Lys Gly Lys Thr Leu Arg Pro Lys Cys Phe。
[0016]本专利技术的多功能小鲵皮肤肽tsin4对革兰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多功能小鲵皮肤肽tsin4，其特征在于，其氨基酸序列为Val Ala Phe Ile Gly His Cys Lys Gly Lys Thr Leu Arg Pro Lys Cys Phe。2.权利要求1所述的多功能小鲵皮肤肽tsin4在制备抗细菌感染药物中的应用。3.权利要求1所述的多功能小鲵皮肤肽tsin4在制备调节炎症反应产品中的应用。4.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙燕，张许林，蔡佳娥，李治，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：