一种经血保存液及经血干细胞的冻存方法技术

一种经血保存液及经血干细胞的冻存方法，包括：所述保存液的成分包括生理盐水、葡萄糖、枸橼酸钠、青霉素组成。经血干细胞冻存方法，采用海藻糖和反式

【技术实现步骤摘要】
一种经血保存液及经血干细胞的冻存方法


[0001]本专利技术属于细胞治疗领域，具体地，本专利技术提供了一种经血保存液及经血干细胞的冻存方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多功能干细胞。间充质干细胞是一种成体干细胞，最早从骨髓中发现的，1976年，Freidenstein首次在骨髓中发现了骨髓间充质干细胞，随后在脐带血、胎盘等多种组织中都发现了间充质干细胞，研究发现间充质干细胞具有多向分化潜能，在体内或体外特定的诱导条件下，可以分化为脂肪、骨、肌肉、神经、肝、心肌等多种组织细胞，目前，根据初步的临床报告，间充质干细胞在脊髓损伤、脑瘫、系统性红斑狼疮、糖尿病、肝硬化等疾病治疗中，都取得了明显的疗效。
[0003]从脊髓组织中获取间充质干细胞是一个有创过程，对捐献者会造成一定的痛苦，而且获得的干细胞数量有限，倍增时间长。胎盘组织或者脐带血干细胞只能在出生时收集，来源溃乏，这些限制因素严重影响了间充质干细胞的临床应用。相比较而言，宫血干细胞具有很多优势，它的取材很方便，不需要专业人士的帮助，使用卫生棉和月事杯就可以无创采集；可以周期性的获得，每月一次，按时报道；增殖能力很强，24小时就可以扩增一倍。这些优点，使宫血干细胞被认为是最具优势与潜力进行大规模临床应用的成体干细胞。
[0004]目前，有多项研究表明，宫血干细胞在体外可以分化为心肌细胞、肺上皮细胞、神经元细胞、肌细胞、内皮细胞、胰岛细胞、干细胞等组织细胞。将宫血干细胞移植到中风小鼠模型后，发现宫血干细胞能够明显减少脑细胞死亡。除此之外，宫血干细胞在心肌梗死、糖尿病、肝硬化等疾病中都显示出了治疗潜力。
[0005]但是宫血干细胞的冻存也存在很多问题，例如：注射了含有DMSO的造血干细胞后引起了腹部疼痛性痉挛，其次常见的冻存液中含有动物血清，而动物血清中可能携带朊病毒等，会造成传播病毒的风险。因此，本专利技术开发了一种替代DMSO、动物血清的冻存液。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术提供了一种经血保存液及经血干细胞的冻存方法，采集女性的经血时对女性外阴清洁消毒，使用高压灭菌的月事杯采集经血，保存于保存液中，从采集源头减少污染几率，保持经血中细胞活性；采集到的经血经分离得到的间充质干细胞种子细胞冻存复苏后细胞活性好，经原代培养细胞增殖活性高，传代培养的细胞活率高，污染率低。
[0007]为了克服现有技术中的不足，本专利技术提供了一种经血保存液及经血干细胞冻存方法的解决方案，具体如下：
[0008]一方面，本专利技术提供了一种经血保存液，其成分包括0.9％的生理盐水、55.5mmol/L
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110mmol/L葡萄糖、10
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12mmol/L枸橼酸钠、100U/mL青霉素、30μmol/L
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50μmol/L木犀草
素。
[0009]另一方面，一种干细胞冻存液，其组成成分为：海藻糖和反式
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羟基
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L
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脯氨酸、丙三醇、四氢甲基嘧啶羧酸、DMEM/F12。
[0010]其中所述的海藻糖在所述细胞冻存液中的含量为2％
‑
9％的所述DMEM/F12的体积；所述丙三醇在所述细胞冻存液中的含量为5
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30％的所述DMEM/F12的体积；所述反式
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羟基
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L
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脯氨酸在所述细胞冻存液中的含量为1
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5％的所述DMEM/F12的体积；所述四氢甲基嘧啶羧酸在所述细胞冻存液中的含量为10
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15％的所述DMEM/F12的体积。
[0011]再一方面一种经血来源间充质干细胞冻存方法，包括如下步骤：S1，经血保存液的配制；S2，经血的采集；S3经血来源间充质干细胞的提取；S4，间充质干细胞的冷冻。
[0012]其中所述的步骤S1为：保存液的基础液为0.9％的生理盐水，之后向其中加入葡萄糖、枸橼酸钠、青霉素、木犀草素，最终葡萄糖浓度为55.5mmol/L
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110mmol/L、枸橼酸钠浓度为10
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12mmol/L、青霉素浓度为100U/mL、木犀草素浓度为30μmol/L
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50μmol/L。
[0013]其中所述的步骤S2为：使用月事杯采集女性经期中第二天到第三天的经血；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌容器中，将经血和保存液充分混匀。
[0014]所述的步骤S3为：将步骤S2中的到的经血在操作台中转移至离心管中，经离心除去上清液后，将剩余液体加入等体积0.9％的生理盐水稀释，稀释后加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，离心，最终得到红细胞层；取红细胞层加入离心管中，接入生理盐水稀释，离心，弃去上清液，最终获得经血间充质细胞。
[0015]所述的步骤S4为：将步骤S3中得到细胞放入冻存液中，放入冻存盒，将冻存盒在
‑
80℃冰箱中预冻12
‑
36h，再放入液氮中保存。
[0016]本专利技术与现有技术相比，有以下优点及益处：
[0017](1)常见的含DMSO、动物血清的冻存液会存在以下不足：注射了含DMSO的造血干细胞可能会造成腹部疼痛性痉挛等不良反应；动物血清中含有病毒(朊病毒等)，会造成传播病毒的风险；血清的组分、批次等都会对细胞产生不同的影响。因此，本专利技术摒弃了DMSO和动物血清，采用海藻糖和反式
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羟基
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L
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脯氨酸、丙三醇、四氢甲基嘧啶羧酸、DMEM/F12来作为冻存剂。
[0018](2)在冻存液中加入海藻糖可以稳定细胞膜，丙三醇能够通过渗透保护细胞内外不受冰晶形成的破坏，四氢甲基嘧啶羧酸可作为渗透剂保护细胞免受高盐损伤。
[0019](3)本专利技术从采取经血到经血来源间充质细胞的冻存都是采用深度灭菌的设备或者设施中进行，因此，种子细胞冻存复苏后细胞活性好，且经过传代培养后，细胞的存活率高，污染性小。
[0020](4)本专利技术经过大量实验研究证明，海藻糖和反式
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羟基
‑
L
‑
脯氨酸、四氢甲基嘧啶羧酸存在一定的协调作用，能够抑制促凋亡蛋白的表达，能够增加细胞活力。
附图说明
[0021]图1为实施例1中样品1冻存复苏后的细胞样貌。
[0022]图2为实施例3中各个样品中促凋亡蛋白Bax的表达水平。
[0023]图3为实施例3中各个样品中p53的表达水平。
具体实施方式
[0024]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种经血保存液，其特征在于,组成成分包括：生理盐水、葡萄糖、枸橼酸钠、青霉素、木犀草素。2.如权利要求1所述的一种经血保存液，其特征在于，其成分为：0.9％的生理盐水、55.5mmol/L
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110mmol/L葡萄糖、10
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12mmol/L枸橼酸钠、100U/mL青霉素、30μmol/L
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50μmol/L木犀草素。3.一种干细胞冻存液，其特征在于，其组成成分为：海藻糖和反式
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羟基
‑
L
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脯氨酸、丙三醇、四氢甲基嘧啶羧酸、DMEM/F12。4.如权利要求3所述的一种细胞冻存液，其特征在于，所述的海藻糖在所述细胞冻存液中的含量为2％
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9％的所述DMEM/F12的体积；所述丙三醇在所述细胞冻存液中的含量为5
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30％的所述DMEM/F12的体积；所述反式
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羟基
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L
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脯氨酸在所述细胞冻存液中的含量为1
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5％的所述DMEM/F12的体积；所述四氢甲基嘧啶羧酸在所述细胞冻存液中的含量为10
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15％的所述DMEM/F12的体积。5.一种经血干细胞冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，经血保存液的...

【专利技术属性】
技术研发人员：史辛艺，
申请(专利权)人：深圳新赛尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：