一种中性粒细胞标志基因集和提高低丰度基因检出率的cDNA扩增方法技术

一种中性粒细胞标志基因集和提高低丰度基因检出率的cDNA扩增方法。本发明专利技术公开了一种针对人

【技术实现步骤摘要】
一种中性粒细胞标志基因集和提高低丰度基因检出率的cDNA扩增方法


[0001]本专利技术属于生物医学
，涉及一种中性粒细胞标志基因集及一种cDNA扩增方法。

技术介绍

[0002]中性粒细胞是最丰富的粒细胞类型，占人类所有白细胞的40％至70％。作为宿主抵抗入侵病原体的第一道防线，中性粒细胞具备固有的吞噬能力，可以吸收纳米颗粒、吞噬死亡的红细胞，并在激活后清除外来病原体和加载靶点，是非常重要的杀伤细胞。中性粒细胞是急性炎症期间的主要反应者之一，当血液中中性粒细胞绝对减少时会导致人类严重的免疫缺陷。中性粒细胞参与人体多种正常功能，研究发现在健康人群中肺部的中性粒细胞能够促进血管的形成，而皮肤中的中性粒细胞有助于保持皮肤上皮的完整性。中性粒细胞也还通过直接杀死肿瘤细胞和参与介导抗肿瘤抵抗的细胞网络来介导抗肿瘤反应，因此，中性粒细胞将会成为未来疾病治疗的重要靶标，基于此前景，目前对于中性粒细胞的研究也越来越多。然而，与其他血液和免疫细胞相比，中性粒细胞中基因表达的数量和水平较低，且又由于单细胞测序技术的局限性，测序数据通常具有高噪音，很多低表达或中度表达的基因无法被有效检测到，从而导致该细胞类型的丢失，这种技术缺陷大大影响了中性粒细胞的研究及其应用前景，所以中性粒细胞的单细胞测序仍是一个重大的挑战。
[0003]单细胞转录组测序技术目前已在生物学研究中得到了广泛的应用，虽然单细胞测序解决了许多生物学问题，但在灵敏度上还是存在着一些局限性，第一，在单细胞转录测序中高表达的mRNA容易被检测到，但是对于表达水平较低的基因很容易丢失。相关的转录本缺失限制了细胞亚型的准确研究，尤其是低丰度转录本，如转录因子、受体和信号分子，这些分子通常对于准确描述细胞过程和命运至关重要。第二，指数扩增由于每一轮都会以上一轮新合成的DNA产物作为模板进行扩增，所以一旦在扩增过程中出现错误，这些错误就会在随后的循环中继续被拷贝并逐步放大，对结果的准确性也会造成很大影响。
[0004]综上所述，亟需针对中性粒细胞开发一种适用于低丰度转录本、快速、易于使用、准确且高灵敏的靶向单细胞转录组学的方法和流程。

技术实现思路

[0005]目前现有10X Genomics单细胞建库技术中采用了指数扩增对mRNA反转录得到的cDNA进行扩增，其中高表达的mRNA在指数扩增中容易被检测到，但是对于表达数量水平较低的，如中性粒细胞标志基因，在细胞类型鉴定时很容易丢失该细胞类型，相关的转录本缺失，限制了细胞亚型的准确研究，且在指数扩增过程中一旦出现错误，这些错误就会在随后的循环中继续被拷贝并逐步放大，对后续测序结果的真实性造成较大影响。故为了解决现有技术存在的不足，本专利技术在大量深入研究和实验的基础上，提供了一组针对人
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全血中性粒细胞的标志基因集，以及适用于低丰度转录本的cDNA扩增方法，该方法简单、准确、无偏
好性，不影响扩增倍数，并可以直接应用于10x Genomics单细胞文库构建中，且本专利技术可直接靶向进行人
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全血中性粒细胞转录组测序，在较少的测序量下，得到更准确可靠的细胞聚类效果，节省实验成本及时间。例如本专利技术中对比实施例1，采用常规10XGenomics建库流程对人
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全血单细胞样本进行文库构建并测序，最终捕获到中性粒细胞数仅有25个，且细胞亚群数仅有1个，而实施例1中在10X Genomics建库流程中使用中性粒细胞标志基因集及cDNA线性扩增方法，最终在测序量降低5倍后捕获中性粒细胞数达到了800个，细胞亚群数检测到8个，有效的提升了单细胞测序对低丰度转录本的灵敏度。
[0006]本专利技术提供了一种人
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全血中性粒细胞的标志基因集。
[0007]其中，所述标志基因集包含33个人
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全血中性粒细胞标志基因，具体为：CD66b、CD15、CD24、CD47、CD11c、CD14、CD10、CD33、CD114、CD123、CD13、CD31、CD32、CD34、CD62L、CD64、CD88、CXCR1、CXCR2、FMLP、GP110、HLA
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DR、JAML、NGAL、TLR2、CXCR4、FLT1、ITGA4、ARG1、FCGR3A、ITGAM、ICAM1、CD95，所述基因序列分别依次如SEQ ID NO.1～33所示。
[0008]所述基因集中的33个基因均属于中性粒细胞低表达水平的标志基因，所述33个基因能够鉴定到8个中性粒细胞亚群，所述亚群及其相关标志基因为未成熟中性粒细胞群(CD15、FCGR3A、ITGAM、CD10、CD34)；成熟中性粒细胞群(CD66b、CXCR2、CXCR4、CD13、GP110、HLA
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DR、NGAL)；老化中性粒细胞群(CD11c、CD24、ICAM1、CD62L、CD47、CXCR4)；促血管生成中性粒细胞群(CXCR4、FLT1、ITGA4)；反向迁移中性粒细胞群(ICAM1、CXCR1、CXCR2、CXCR4)；多形核MDSC(ARG1、CD33、FMLP、FCGR3A、ITGAM)；未鉴定亚群1(TLR2、CD14、CD114、CD32、CD88、CD64)；未鉴定亚群2(CD123、CD95、CD31)。
[0009]本专利技术中所述人
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全血中性粒细胞标志基因集为适用于10x Genomics单细胞靶向转录组测序的人
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全血中性粒细胞标志基因集。
[0010]本专利技术还提供了所述人
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全血中性粒细胞标志基因集在10X Genomics转录组测序中提高中性粒细胞低丰度基因检出率及中性粒细胞亚群聚类鉴定中的应用。
[0011]本专利技术还提供了一种适用于低丰度转录本的10x Genomics cDNA扩增方法的扩增引物，正向引物设计为经封阻修饰的read1互补序列，反向为set基因的特异性引物池。
[0012]其中，所述正向封阻(blocker)修饰为3
’
C3 Spacer。具体地，所述正向引物为：(5
’
)CTACACGACGCTCTTCCGATCT(3
’
)，3
’
端经C3 Spacer修饰。
[0013]其中，所述反向引物为依照标志基因集中的33个基因，经特殊设计的具有高度特异性且引物序列互不影响的混合引物池。具体地，所述反向引物池的序列如SEQ ID NO.34
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66之任一项所示。
[0014]本专利技术还提供了所述扩增引物在低丰度转录本的10x Genomics cDNA扩增方法中的应用。
[0015]本专利技术还提供了一种适用于人
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全血中性粒细胞标志基因集的可嫁接到10x Genomics文库构建流程中的cDNA线性扩增方法(步骤4～步骤8)，包括如下具体步骤：
[0016]步骤(1)：使用10x Genomics的Chromi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人
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全血中性粒细胞的标志基因集，其特征在于，其包含CD66b、CD15、CD24、CD47、CD11c、CD14、CD10、CD33、CD114、CD123、CD13、CD31、CD32、CD34、CD62L、CD64、CD88、CXCR1、CXCR2、FMLP、GP110、HLA
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DR、JAML、NGAL、TLR2、CXCR4、FLT1、ITGA4、ARG1、FCGR3A、ITGAM、ICAM1、CD95，所述基因序列分别依次如SEQ ID NO.1～33所示。2.如权利要求1所述的人
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全血中性粒细胞的标志基因集，其特征在于，所述基因集中的基因均属于中性粒细胞低表达水平的标志基因，所述33个基因能够鉴定到8个中性粒细胞亚群，所述亚群及其相关标志基因为未成熟中性粒细胞群CD15、FCGR3A、ITGAM、CD10、CD34；成熟中性粒细胞群CD66b、CXCR2、CXCR4、CD13、GP110、HLA
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DR、NGAL；老化中性粒细胞群CD11c、CD24、ICAM1、CD62L、CD47、CXCR4；促血管生成中性粒细胞群CXCR4、FLT1、ITGA4；反向迁移中性粒细胞群ICAM1、CXCR1、CXCR2、CXCR4；多形核MDSC ARG1、CD33、FMLP、FCGR3A、ITGAM；未鉴定亚群1TLR2、CD14、CD114、CD32、CD88、CD64；未鉴定亚群2CD123、CD95、CD31。3.如权利要求1所述的人
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全血中性粒细胞的标志基因集在10X Genomics单细胞转录组测序中低丰度基因检出及中性粒细胞亚群聚类鉴定中的应用。4.一种扩增引物，其特征在于，正向引物设计为经封阻修饰的read1互补序列，具体序列为：(5
’
)CTACACGACGCTCTTCCGATCT(3
’
)，3
’
端经C3 Spacer修饰；反向引物为根据权利要求1所述33个集合基因合成的特异性引物池，序列如SEQ ID NO.34～66所示。5.如权利要求4所述的扩增引物在10x Genomics文库构建过程中针对低丰度转录本的cDNA线性扩增方法中的应用。6.一种适用于人
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全血中性粒细胞标志基因集的可嫁接到10x Genomics文库构建流程中的cDNA线性扩增方法，其特征在于，包括如下具体步骤：步骤(1)：使用10x Genomics的Chromium Single Cell 3
′
v3.1凝胶珠试剂盒将分离后的人
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全血单细胞悬液加载到10x芯片的通道上以生产油滴包裹的凝胶珠GEMs；步骤(2)：在GEMs中将用Poly(dT)捕获的样品RNA反转录为带细胞标签的cDNA；步骤(3)：将GEMs破裂，把所有细胞的cDNA合并在一起；步骤(4)：通过前期实验数据积累，初步筛选出若干有助于中性粒细胞分群...

【专利技术属性】
技术研发人员：王佳琦，范黎明，朱燕敏，李想，佟思雨，殷昊，肖云平，
申请(专利权)人：上海欧易生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：