一种可发酵合成TerrequinoneA的重组大肠杆菌及其制备方法以及应用技术

本发明专利技术涉及一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌及其制备方法以及应用。将Terrequinone A合成途径所需的六个基因进行优化后获得tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因和sfpS基因，分别构建基因表达盒，并按T7tdiDS、T7tdiAS、T7sfpS、T7tdiBS、T7tdiCS和T7tidES的顺序串联构建重组质粒pC04，转化大肠杆菌，获得的重组工程菌通过发酵可合成具有抗癌细胞生物活性的Terrequinone A，其发酵液中Terrequinone A的含量为1.8mg/L，在生物制药领域具有潜在的应用价值。用价值。用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌及其制备方法以及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌及其制备方法以及应用。

技术介绍

[0002]双吲哚醌类化合物是一类具有抗逆转录病毒、抗糖尿病或细胞毒性生物活性的真菌天然产物。双吲哚醌自可皆霉素(Cochliodinol)被发现以来，其家族成员不断壮大，而在这其中，从沙漠植物根际真菌土曲霉(Aspergillus terreus)中首次分离出来的Terrequinone A，对四种人类癌细胞(NCIH460、MCF
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7、SF
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268和MIA Pa Ca
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2)具有中等细胞毒性，是一种潜在的抗癌药物(He et al.,Journal of Natural Products,2004,67(12):1985
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1991)，也是唯一一种有生物合成信息的双吲哚醌类化合物。2004年，Bok等人利用转录调控因子LaeA对构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的次生代谢组进行了挖掘，识别了Terrequinone A的合成基因簇tdiABCDE(Bok et al.,Eukaryotic Cell,2004,3(2):527
‑
535)。
[0003]Terrequinone A作为一种天然产物，其结构复杂、官能团较多，采用化学合成法所需步骤多、产率低以及环境不友好，随着Terrequinone A在生物体内进行合成和修饰的特殊途径被阐明，利用生物催化法合成Terrequinone A成为一种有效的尝试，Balibar等人分别过表达和研究了tdiABCDE基因簇中的5个基因，通过酶的体外分步反应成功合成了Terrequinone A(Carl J Balibar等人,Terrequinone A biosynthesis through L
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tryptophan oxidation,dimerization and bisprenylation,Nature Chemical Biology,2007,3(9):584
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592)。然而，体外合成需要外源性地添加昂贵的辅因子和辅因子再生酶系；另外，游离酶催化体系中一种酶催化的产物往往是下一个酶的底物，其底物产物的传递通常受到空间的限制，降低了产物的合成效率。因此，需要寻求更加高效的方法来生产Terrequinone A。大肠杆菌作为一种优良的生物反应器，通过对其进行合成途径的改造或引入新的代谢途径，可用于生物合成高价值天然产物，它能完美地规避上述两个问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌及其制备方法以及应用，从而解决现有技术中Terrequinone A的体外合成方法存在的生产成本较高、合成效率低下的问题。
[0005]为了解决上述问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]根据本专利技术的第一方面，提供一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌的制备方法，包括以下步骤：S1：对tdiA基因、tdiB基因、tdiC基因、tdiD基因、tidE基因和sfp基因按大肠杆菌表达模式优化，分别获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因和sfpS基因，将所述六个基因分别与T7启动
子和终止子连接，构建基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES和T7 sfpS；S2：将步骤S1获得的六个基因表达盒按T7 tdiDS、T7 tdiAS、T7sfpS、T7 tdiBS、T7 tdiCS和T7 tidES的顺序串联，连接入大肠杆菌表达载体，构建重组质粒pC04；S3：将步骤S2获得的重组质粒pC04转化入大肠杆菌BL21
‑
AI中，获得一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌。
[0007]优选地，步骤S2中，所述大肠杆菌表达载体为pCAMBIA1301。
[0008]优选地，步骤S2中，在T7 tdiDS的5
’‑
端连接EcoRⅠ内切酶位点，在T7 tidES的3
’‑
端连接HindⅢ内切酶位点，获得EcoR
Ⅰ‑
T7 tdiDS
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T7tdiAS
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T7 sfpS
‑
T7 tdiBS
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T7 tdiCS
‑
T7 tidES
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HindⅢ。
[0009]根据本专利技术的第二方面，提供一种用于生产Terrequinone A的重组质粒pC04，所述重组质粒pC04由基因表达盒按T7 tdiDS、T7 tdiAS、T7sfpS、T7 tdiBS、T7 tdiCS和T7 tidES的顺序串联并连接入大肠杆菌表达载体上构建而成，其中，所述基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES和T7 sfpS由核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因和sfpS基因分别与T7启动子和终止子连接而成。
[0010]根据本专利技术的第三方面，提供一种根据上述制备方法获得的可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌。
[0011]根据本专利技术的第四方面，提供一种利用重组大肠杆菌发酵合成Terrequinone A的方法，将所述重组大肠杆菌接种于含50μg/ml卡那霉素的M9液体培养基中进行发酵培养，加入L
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阿拉伯糖诱导，以L
‑
色氨酸为底物，即可发酵合成Terrequinone A。
[0012]优选地，所使用的M9液体培养基每升含有：15g甘油(glycerol)，6g Na2HPO4，3g KH2PO4，1g NH4Cl，0.5g NaCl，0.12g MgSO4，0.011g CaCl2，2.9mg ZnSO4·
7H2O，0.2mL 1％(w/v)维生素B1(vitamin B1)以及5g水解酪蛋白(acid
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hydrolyzed casein)。
[0013]优选地，加入的所述L
‑
阿拉伯糖的浓度为0.2％，在25℃温度下诱导培养14～18h。
[0014]优选地，在诱导培养后，加入浓度为0.5g/L的L
‑
色氨酸，在30℃培养22～26h，即可。
[0015]本专利技术中，根据大肠杆菌的密码子偏好性对tdiA基因、tdiB基因、tdiC基因、tdiD基因、tidE基因和sfp基因作为整体进行优化，优化原则包括：(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：对tdiA基因、tdiB基因、tdiC基因、tdiD基因、tidE基因和sfp基因按大肠杆菌表达模式优化，分别获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因和sfpS基因，将优化后的上述六个基因分别与T7启动子和终止子连接，构建基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES和T7 sfpS；S2：将步骤S1获得的六个基因表达盒按T7 tdiDS、T7 tdiAS、T7sfpS、T7 tdiBS、T7 tdiCS和T7 tidES的顺序串联，连接入大肠杆菌表达载体，构建重组质粒pC04；S3：将步骤S2获得的重组质粒pC04转化入大肠杆菌BL21
‑
AI中，获得一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述大肠杆菌表达载体为pCAMBIA1301。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，在T7 tdiDS的5
’‑
端连接EcoRⅠ内切酶位点，在T7 tidES的3
’‑
端连接HindⅢ内切酶位点，获得EcoR
Ⅰ‑
T7 tdiDS
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T7 tdiAS
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T7 sfpS
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T7 tdiBS
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T7 tdiCS
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T7 tidES
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HindⅢ。4.一种用于生产Terrequino...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽娟，姚泉洪，彭日荷，田永生，高建杰，李振军，张文慧，邓永东，王波，许晶，王宇，付晓燕，韩红娟，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：