一种用于模块化组分SpyTag蛋白的通用型免疫亲和层析柱、其制备方法及纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种用于模块化组分SpyTag蛋白的通用型免疫亲和层析柱、其制备方法及纯化方法，旨在解决目前SpyTag蛋白纯化复杂、困难的技术问题。本发明专利技术通过基因工程技术将SpyTag003高密度展示在HBV核心抗原(HBc)表面，在大肠杆菌中表达并自组装形成纳米颗粒，以其免疫小鼠，杂交瘤方法筛选得到高亲和力的SpyTag003单克隆抗体；将该隆抗体共价固定在AminoLink

【技术实现步骤摘要】
一种用于模块化组分SpyTag蛋白的通用型免疫亲和层析柱、其制备方法及纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种用于模块化组分SpyTag蛋白的通用型免疫亲和层析柱、其制备方法及纯化方法。

技术介绍

[0002]SpyTag/SpyCatcher是一种用于模块化疫苗组装的明星分子，提供了一种简便的蛋白质共价缀合途径，具有高度的稳健性和通用性，目前已经应用于多种候选疫苗和个性化肿瘤新抗原治疗性疫苗中。这一系统是通过从化脓性链球菌的纤连蛋白结合蛋白FbaB中裂解CnaB2结构域而产生，两个组分间能够自发地形成分子内异肽键，在一定温度(至少4～37℃)、pH值(5～8)、缓冲液(不需要特定的阴离子或阳离子)下甚至使用非离子去污剂时均能实现快速组装。SpyTag003/SpyCatcher003是该类系统的最新版本，其解决了SpyTag/SpyCatcher的中等反应速率限制低浓度蛋白质的时间分辨率和标记效率问题，经改造后反应速率(5.5
×
105M
‑1s
‑1)接近扩散极限，比原先的SpyTag/SpyCatcher反应速率(1.4
×
103M
‑1s
‑1)快约400倍；即使在低蛋白浓度(10nM)下，SpyTag003/SpyCatcher003反应也能在在15min内完成90%以上，而此时几乎没有原始SpyTag/SpyCatcher的反应。目前，SpyTag003/SpyCatcher003的超高效反应性使其成为了合成生物学家工具包中的更优选择。
[0003]基于SpyTag/SpyCatcher系统在模块化疫苗生产中的潜力，作为其关键组件之一的SpyTag蛋白的纯化是一个现实且亟待解决的问题。目前绝大多数SpyTag蛋白在设计时都被加上了额外的标签，如His标签，以用作纯化。然而这些标签通常在完成纯化后没有任何用途了，还会在体内产生无益的免疫应答。而当洗脱后组分的纯度不够，或者由于His标签没有充分暴露导致样品根本不挂纯化柱时，还需要进一步佐以其它纯化方法。此外，在研究中常常需要制备多种候选SpyTag抗原，当它们由于自身的差异而需要采用不同的方法纯化时，生产步骤将变得异常复杂。因此，如果能够针对原有的SpyTag标签建立一种更为简便通用的纯化方法，使SpyTag标签在行使组装功能之外，直接被用于纯化，将大大提高这一模块组分的生产效率。
[0004]得益于抗原与抗体之间的高度特异性亲和力，免疫亲和层析(IAC)发展成为一种强有力的纯化方法。它是亲和色谱的一个特殊子类别，其中固定相由抗体或抗体相关试剂组成。使用针对SpyTag的单克隆抗体作为固定配体特异性地将SpyTag标签蛋白从复杂样品中分离出来是一种极具希望且可行的纯化方法。
[0005]公开于该
技术介绍
部分的信息仅用于加深对本公开的
技术介绍
的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0006]专利技术人通过研究发现：由于SpyTag分子量较小，难以诱导足够高的抗体水平，是制约基于SpyTag标签蛋白进行纯化分离蛋白的瓶颈性因素；而利用纳米颗粒展示的方式则能
够促进抗原引流至淋巴结、补体激活、抗原呈递细胞(APC)摄取和B细胞受体(BCR)交联，继而诱导针对所展示抗原的强烈体液反应，产生更高水平的抗体；进一步的研究发现，通过基因工程技术将SpyTag003高密度展示在乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBc)表面，在大肠杆菌中表达并自组装形成纳米颗粒；将其作为免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术能够筛选到高亲和力的SpyTag003单克隆抗体。
[0007]鉴于此，在本专利技术申请中利用HBc纳米颗粒多价展示SpyTag003标签，制备高亲和力SpyTag003单克隆抗体，为SpyTag蛋白的分离纯化建立一种全新的、通用的、基于单克隆抗体的亲和免疫层析方法；并以所构建的多种不同标签位置、不同表达来源的SpyTag模式蛋白作为纯化验证模型，对所得蛋白的纯度以及组装能力进行了表征确认，从而为SpyTag蛋白的高效分离纯化提供了新的有效途径。
[0008]根据本公开的一个方面，提供一种免疫亲和层析柱，含有固相载体醛基活化的交联珠状琼脂糖和与其偶联的HBC
‑
SpyTag003单克隆抗体；所述抗HBC
‑
SpyTag003单克隆抗体的重链可变区序列为如SEQ ID NO.2所示的DNA序列或如SEQID NO.3所示的氨基酸序列，或为在所述SEQ ID NO.3序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换而获得活性片段或保守性变异体的序列；和/或其轻链可变区DNA序列为如SEQ ID NO.4所示的DNA序列，或为如SEQID NO.5所示的氨基酸序列，或为在所述SEQ ID NO.5序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。
[0009]在本公开的一些实施例中，所述HBC
‑
SpyTag003单克隆抗体经由以下方法制得：（1）合成DNA序列如SEQ ID NO.1所示的HBC
‑
SpyTag003融合基因，并将其克隆至pET28a载体构建原核表达载体；（2）将所得原核表达载体转化大肠杆菌形成原核表达菌株，再经IPTG诱导表达、菌体裂解、纯化步骤得含HBC
‑
SpyTag003的纳米颗粒；（3）以所述纳米颗粒为免疫原，经杂交瘤方法而制得HBC
‑
SpyTag003单克隆抗体。
[0010]在本公开的一些实施例中，在所述步骤（2）中，纯化方法包括：
①
以饱和硫酸铵溶液对菌体裂解液进行沉淀，并通过透析去除残留的硫酸铵；
②
再通过装填Capto
TM
Core 700填料的层析柱，收集流穿液即得到纯化的纳米颗粒。
[0011]根据本公开的另一个方面，提供一种免疫亲和层析柱的制备方法，包括如下步骤：（1）单克隆抗体制备
①
合成DNA序列如SEQ ID NO.1所示的HBC
‑
SpyTag003融合基因，并将其克隆至pET28a载体构建原核表达载体；
②
将所得原核表达载体转化大肠杆菌形成原核表达菌株，再经IPTG诱导表达、菌体裂解、纯化步骤得含HBC
‑
SpyTag003的纳米颗粒；
③
以所述纳米颗粒为免疫原，经杂交瘤方法而制得HBC
‑
SpyTag003单克隆抗体；（2）单克隆抗体固定化于色谱柱中，在还原剂氰基硼氢化钠的作用下，使醛基活化的琼脂糖载体与所述HBC
‑
SpyTag003单克隆抗体进行稳健固定；（3）阻止剩余活动站点：于通风条件下向色谱柱中加入淬灭缓冲液和氰基硼氢化
物溶液，摇晃混合25～35 min，随后排出色谱柱内容液；（4）洗涤柱：以1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免疫亲和层析柱，其特征在于，含有固相载体醛基活化的交联珠状琼脂糖和与其偶联的HBC
‑
SpyTag003单克隆抗体；所述抗HBC
‑
SpyTag003单克隆抗体的重链可变区序列为如SEQ ID NO.2所示的DNA序列或如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或为在所述SEQ ID NO.3序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换而获得活性片段或保守性变异体的序列；和/或其轻链可变区DNA序列为如SEQ ID NO.4所示的DNA序列，或为如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，或为在所述SEQ ID NO.5序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。2.根据权利要求1所述的免疫亲和层析柱，其特征在于，所述HBC
‑
SpyTag003单克隆抗体经由以下方法制得：（1）合成DNA序列如SEQ ID NO.1所示的HBC
‑
SpyTag003融合基因，并将其克隆至pET28a载体构建原核表达载体；（2）将所得原核表达载体转化大肠杆菌形成原核表达菌株，再经IPTG诱导表达、菌体裂解、纯化步骤得含HBC
‑
SpyTag003的纳米颗粒；（3）以所述纳米颗粒为免疫原，经杂交瘤方法而制得HBC
‑
SpyTag003单克隆抗体。3.根据权利要求2所述的免疫亲和层析柱，其特征在于，在所述步骤（2）中，纯化方法包括：
①
以饱和硫酸铵溶液对菌体裂解液进行沉淀，并通过透析去除残留的硫酸铵；
②
再通过装填Capto
TM
Core 700填料的层析柱，收集流穿液即得到纯化的纳米颗粒。4.权利要求1所述免疫亲和层析柱的制备方法，包括如下步骤：（1）单克隆抗体制备
①
合成DNA序列如SEQ ID NO.1所示的HBC
‑
SpyTag003融合基因，并将其克隆至pET28a载体构建原核表达载体；
②
将所得原核表达载体转化大肠杆菌形成原核表达菌株，再经IPTG诱导表达、菌体裂解、纯化步骤得含HBC
‑
SpyTag003的纳米颗粒；
③
以所述纳米颗粒为免疫原，经杂交瘤方法而制得HBC
‑
SpyTag003单克隆抗体；（2）单克隆抗体固定化于色谱柱中，在还原剂氰基硼...

【专利技术属性】
技术研发人员：张改平，丁培阳，王爱萍，刘红亮，陈玉梅，周景明，朱习芳，梁超，祁艳华，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：