一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种无血清细胞冻存液包含80%(v/v)至90%(v/v)的无血清细胞培养基、4%(v/v)至6%(v/v)的二甲基亚砜、0.5%(w/v)至1.2%(w/v)的维生素、0.05%(w/v)至0.3%(w/v)的氨基酸、0.0001%(w/v)至0.0004%(w/v)的脂类、0.2%(w/v)至1.0%(w/v)的甘露糖、2%(w/v)至4%(w/v)羟乙基淀粉和余量的水。本申请的无血清细胞冻存液不包含血清，减少了动物来源的污染，含较低DMSO成分，降低了冻存液对细胞的毒性并且显著提高了细胞冻存后复苏的活率。性并且显著提高了细胞冻存后复苏的活率。性并且显著提高了细胞冻存后复苏的活率。

【技术实现步骤摘要】
一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体涉及一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]由于细胞的特殊性，在细胞培养过程中，或在细胞建株和建系过程中，随着传代次数的增加，细胞的各种生物特性都会逐渐发生变化。因此，原始细胞种子的及时保存就显得尤为必要。在细胞悬液的冷冻过程中，冰晶的形成是导致细胞死亡的主要原因之一。细胞冻存液作为细胞冻存时必须使用的一种溶液，其作用是将需要冻存的细胞悬浮，并供给细胞生命代谢所需的营养物质，同时防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤。
[0003]传统的冻存液配制中含有血清，由于其动物来源的特性，会极大带来病毒等感染物质的可能，而且，血清来源受限，价格昂贵，所以其使用也必然会受到越来越多的限制。在冻存使用上来说，传统冻存方式需要用慢冻快融的方式来保存和保护细胞不受损，标准冷冻速度开始为
‑
1到
‑
2℃/分钟，当温度低于
‑
25℃时可加速，到
‑
70℃之后可直接投入液氮内(
‑
196℃)，此方法较为繁琐，给操作带来较大不便。而无血清细胞冻存液中不含血清，即可避免动物来源病毒的污染。此外，在冻存方法上可以不采用程序性降温的方式，直接将重悬于无血清细胞冻存液中的细胞放在
‑
80℃保存，给实验步骤缩减了复杂的工序。
[0004]无血清细胞冻存液里添加了细胞冻存保护剂，冻存保护剂分为细胞外保护剂和细胞内保护剂，细胞外保护剂即非渗透性保护剂，分子量较大被截留在细胞外，非渗透性保护剂通过稀释降低胞外电解质的浓度，减少溶质损伤，结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶的形成。通常作为细胞外保护剂的物质成分有：海藻糖、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、羟乙基淀粉等。细胞内保护剂即渗透性保护剂主要作用是防止细胞内的冰晶形成、避免高浓度冻存剂的毒性和使细胞在耐受度内脱水，如甘油、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇等。其中，DMSO具有毒性，高浓度的DMSO会对细胞造成伤害，降低DMSO含量或者找到它的替代性物质是较优的办法，可是目前来说，很难找到能完全替代DMSO的保护性物质。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用，本专利技术相较于传统方式的冻存液的优势在于不含血清且DMSO含量较低，细胞冻存复苏后活率较高，该无血清冻存液具有高效、低毒、无外源因子和易于使用等优点，可广泛用于各种哺乳动物细胞的冷冻保存。
[0006]为实现上述技术目的，本专利技术提供的一种无血清细胞冻存液包含80％(v/v)至90％(v/v)的无血清细胞培养基、4％(v/v)至6％(v/v)的二甲基亚砜、0.5％(w/v)至1.2％(w/v)的维生素、0.05％(w/v)至0.3％(w/v)的氨基酸、0.0001％(w/v)至0.0004％(w/v)的脂类、0.2％(w/v)至1.0％(w/v)的甘露糖、2％(w/v)至4％(w/v)羟乙基淀粉和余量的水。
[0007]其中，所述无血清培养基为RPMI
‑
1640培养基、DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基
和F12培养基中的任意一种几种的混合物。
[0008]在一种优选的实施方式中，所述无血清培养基为DMEM培养基和F12培养基按照1:1混合组成的混合培养基。
[0009]优选地，所述脂类为乙醇胺；所述维生素为维生素C。
[0010]所述氨基酸为苏氨酸和丝氨酸。
[0011]在一个优选的实施方式中，所述冻存液包含85％(v/v)的无血清细胞培养基、5％(v/v)的二甲基亚砜、0.8％(w/v)的维生素C、0.15％(w/v)的苏氨酸、0.2％(w/v)的丝氨酸、0.0001％(w/v)的乙醇胺、0.3％(w/v)的甘露糖、2％(w/v)的羟乙基淀粉和余量的水。
[0012]本专利技术进一步提出了上述无血清细胞冻存液的制备方法，包括如下步骤：
[0013](1)在cGMP洁净级车间里，向配方量的无血清培养基中逐步添加配方量的氨基酸、乙醇胺、甘露糖、维生素C、羟乙基淀粉、二甲基亚砜和无菌水；
[0014](2)将步骤(1)中所得的溶液进行过滤灭菌处理，即得到无血清细胞冻存液。
[0015]本专利技术进一步提出了上述冻存液的使用方法，其中，冻存方法包括如下步骤:
[0016](1)使用所述冻存液将待冻存的细胞稀释成细胞悬液；所述细胞悬浮液的浓度为1
×
106个细胞/ml
‑1×
107个细胞/ml；
[0017](2)将步骤(1)得到的细胞冻存悬液放入
‑
80℃冰箱保存。
[0018]有益效果：本申请的无血清细胞冻存液不包含血清，减少了动物来源的污染，含较低DMSO成分，降低了冻存液对细胞的毒性并且显著提高了细胞冻存后复苏的活率。
附图说明
[0019]图1为实验例3中MUM
‑
2B细胞复苏后的生长状况图；
[0020]图2为实验例3中H460细胞复苏后的生长状况图；
[0021]图3为实验例3中293T细胞复苏后的生长状况图。
具体实施方式
[0022]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]本申请提出的无血清细胞冻存液包括无血清培养基、二甲基亚砜(DMSO)、维生素、氨基酸、脂类、甘露糖、羟乙基淀粉和无菌水。
[0024]其中，无血清培养基选自RPMI
‑
1640培养基、DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基和F12培养基组成的组中的一种或混合培养基。
[0025]无血清细胞冻存液的制备方法如下：
[0026](1)在cGMP洁净级车间里，向配方量的无血清培养基中逐步添加配方量的氨基酸、乙醇胺、甘露糖、维生素C、羟乙基淀粉、二甲基亚砜和无菌水；
[0027](2)将步骤(1)中所得的溶液进行过滤灭菌处理，即得到无血清细胞冻存液。
[0028]冻存方法包括如下步骤：
[0029](1)使用所述冻存液将待冻存的细胞稀释成细胞悬液；所述细胞悬浮液的浓度为1
×
106个细胞/ml
‑1×
107个细胞/ml；
[0030](2)将步骤(1)得到的细胞冻存悬液放入
‑
80℃冰箱保存。
[0031]下面通过具体的实施例详细说明本专利技术。
[0032]下述实施例中使用的无血清细胞培养基为DMEM培养基和F12培养基按照1:1混合组成。
[0033]实施例1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无血清细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液包含80%(v/v)至90%(v/v)的无血清细胞培养基、4%(v/v)至6%(v/v)的二甲基亚砜、0.5%(w/v)至1.2%(w/v)的维生素、0.05%(w/v)至0.3%(w/v)的氨基酸、0.0001%(w/v)至0.0004%(w/v)的脂类、0.2%(w/v)至1.0% (w/v)的甘露糖、2%(w/v)至4% (w/v)羟乙基淀粉和余量的水。2.根据权利要求1所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述无血清培养基为RPMI
‑
1640培养基、DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基和F12培养基中的任意一种几种的混合物。3.根据权利要求1或2所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述无血清培养基为DMEM培养基和F12培养基按照1:1混合组成的混合培养基。4.根据权利要求1所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述脂类为乙醇胺。5.根据权利要求1所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述维生素为维生素C。6.根据权利要求1所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述氨基酸为苏氨酸和丝氨酸。7.根据权利要求1所述的无血...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙益军，花香玉，黄莺，张峰，杨文骏，
申请(专利权)人：江苏凯基生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：