调控桃抗蚜性的PpWRKY4基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了调控桃抗蚜性的PpWRKY4基因及应用，所述PpWRKY4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述PpWRKY4基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。本发明专利技术以蚜虫接种前后的抗蚜桃品种叶片为材料进行转录组测序，首次发现PpWRKY4基因对于蚜虫抗性的影响。同时本发明专利技术通过将PpWRKY4过表达载体转化到拟南芥中进行验证，结果证明过表达PpWRKY4基因的拟南芥上蚜虫数目明显少于野生型。本发明专利技术为培育抗蚜桃品种奠定了基础。品种奠定了基础。品种奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
调控桃抗蚜性的PpWRKY4基因及应用


[0001]本专利技术涉及调控桃抗蚜性的PpWRKY4基因及应用，属于农业生物


技术介绍

[0002]桃蚜(Myzuspersicae S
ü
lzer)，又叫桃赤蚜、腻虫、烟蚜、油汉，属同翅目，蚜科。桃蚜分布范围广，在朝鲜、日本、印度尼西亚、印度以及北美、欧洲、非洲等地均有发生，是世界上分布最广的蚜虫之一，在我国桃主要产区均有分布。桃蚜寄主范围广，可以在50多科400多种植物上取食，主要包括桃、李等蔷薇科植物，油菜等十字花科植物，烟草、马铃薯等茄科植物。并且，桃蚜的传毒能力强，可传播115种植物病毒，占整个蚜虫传播的植物病毒的67.7％。桃蚜会对作物产生严重危害。受桃蚜侵食后的植物幼叶向反面横卷或不规则卷曲，阻碍叶片的营养吸收，使叶片营养恶化，甚至黄落。蚜虫排泄在叶片上的蜜露易诱发霉污病，干扰植物的光合作用，严重影响作物的产量和品质。桃蚜的繁殖力很强，世代重叠现象突出，孤雌繁殖，适应性强，是最难防治的害虫之一。
[0003]目前，对于桃蚜的防治主要依赖于杀虫剂。但由于近年来烟碱类杀虫剂的广泛使用，桃蚜已经对其产生抗药性，防治难度增加；另外，广谱型杀虫剂的大量使用对授粉昆虫和天敌昆虫也产生严重危害，并对果园的生态环境造成破坏。因此挖掘抗性资源的抗蚜基因、培育抗桃蚜新品种，是桃资源和育种研究工作的重要环节。本专利技术利用抗蚜资源挖掘到一个参与桃抗蚜过程的WRKY基因，为培育抗蚜桃品种奠定了基础。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一个首次从桃中获得的PpWRKY4基因，该基因具有调控抗蚜的功能。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案之一是提供：
[0006]调控桃抗蚜性的PpWRKY4基因，所述PpWRKY4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]所述PpWRKY4基因为完整的编码547个氨基酸的ORF。
[0008]所述PpWRKY4基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。
[0009]本专利技术的技术方案之一是提供：PpWRKY4基因在调控桃抗蚜性中的应用。
[0010]具体的，在蚜虫侵染后，所述PpWRKY4基因在桃叶片中被诱导表达。
[0011]具体方法为：所述PpWRKY4基因与载体pRI101
‑
AN正向连接后得到pRI101
‑
PpWRKY4重组表达载体，将所述pRI101
‑
PpWRKY4重组表达载体转化到DH5α大肠杆菌中，筛选阳性菌提取质粒，将测序验证过表达载体中的PpWRKY4基因序列正确的质粒转化农杆菌菌株GV3101，制备侵染液，将拟南芥植株的地上部位倒置于侵染液中，暗培养过夜，即可正常栽培管理。
[0012]本专利技术的有益效果：
[0013]本专利技术以蚜虫接种前后的抗蚜桃品种叶片为材料进行转录组测序，首次发现
PpWRKY4基因对于蚜虫抗性的影响。同时本专利技术通过将PpWRKY4过表达载体转化到拟南芥中进行验证，结果证明过表达PpWRKY4基因的拟南芥上蚜虫数目明显少于野生型。本专利技术为培育抗蚜桃品种奠定了基础。
附图说明
[0014]图1为桃PpWRKY4基因与其他物种同源基因蛋白系统进化树。
[0015]图2为蚜虫侵染前后，抗蚜单株(R32)和感蚜单株(S27)的桃叶片中PpWRKY4基因的表达量。图中，R0、R6、R12、R24、R48分别代表R32接种蚜虫后0、6、12、24、48h的PpWRKY4基因的表达量。S0、S6、S12、S24、S48分别代表S27接种蚜虫后0、6、12、24、48h的PpWRKY4基因的表达量。小写字母的不同表示具有显著性差异(p<0.05)。
[0016]图3为转基因拟南芥与野生型拟南芥中PpWRKY4基因的表达量。图中，小写字母的不同表示具有显著性差异(p<0.05)。
[0017]图4为转基因拟南芥与野生型拟南芥上蚜虫的数量变化。
具体实施方式
[0018]以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。
[0019]实施例
[0020]一、基因筛选
[0021]以蚜虫接种前后的帚形山桃杂交F2群体中抗蚜山桃叶片为材料，参考通用植物RNA提取试剂盒(北京华越洋生物)说明书提取总RNA，用Nanodrop 1000微量紫外可见光分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量RNA浓度及OD
260
/
280
值，然后使用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)反转录成cDNA，反应体系及程序见说明书。
[0022]以蚜虫接种前后的帚形山桃杂交F2群体中抗蚜山桃叶片为材料进行转录组测序，通过比较抗蚜前后的基因表达水平，筛选到与抗蚜相关的PpWRKY4基因。桃PpWRKY4基因编码的蛋白序列与其它物种同源基因蛋白系统进化关系见图1。
[0023]二、实时荧光定量PCR验证
[0024]以蚜虫侵染后0、6、12、24、48h的帚形山桃杂交F2群体中抗蚜单株(R32)和感蚜单株(S27)的桃叶片为材料，参考步骤一的方法合成cDNA。
[0025]以cDNA为模板，设计引物，用SYBR Green I法进行Real
‑
time PCR(荧光定量PCR)扩增，定量分析蚜虫侵染前后，抗蚜和感蚜品种的桃叶片中PpWRKY4基因的表达量。
[0026]通过NCBI设计荧光定量PCR的引物，序列如下：
[0027]上游引物：5
’‑
ATTTGATGGTGGCTCGGTCG
‑3’
(SEQ ID NO.3)
[0028]下游引物：5
’‑
TTCCAAATGGACTCGGAGGTG
‑3’
(SEQ ID NO.4)
[0029]以桃Actin基因作为内参基因，其引物序列如下：
[0030]上游引物：5
’‑
GATTCCGGTGCCCAGAAGT
‑3’
(SEQ ID NO.5)
[0031]下游引物：5
’‑
CCAGCAGCTTCCATTCCAA
‑3’
(SEQ ID NO.6)
[0032]PCR扩增体系如表1：
[0033]表1 Real
‑
time PCR扩增体系
[0034][0035]所用仪器为Roche 480II实时荧光定量PCR系统，扩增程序如表2。
[0036]表2 Real
‑
time PCR扩增程序
[0037][0038]相对表达量的计算采用2
‑
ΔΔCt
法。用SPSS软件对蚜虫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.调控桃抗蚜性的PpWRKY4基因，其特征在于，所述PpWRKY4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的PpWRKY4基因，其特征在于，所述PpWRKY4基因为完整的编码547个氨基酸的ORF。3.根据权利要求2所述的PpWRKY4基因，其特征在于，所述PpWRKY4基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。4.PpWRKY4基因在调控桃抗蚜性中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在蚜虫侵染后，所述PpWRKY4基因在桃叶片中被诱导表达。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：王力荣，王君秀，李勇，曹珂，朱更瑞，王新卫，陈昌文，方伟超，吴金龙，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：