一种核酸外切酶突变体及包含该突变体的核酸等温扩增反应体系制造技术

本发明专利技术公开了一种核酸外切酶突变体及包含该突变体的核酸等温扩增反应体系，所述核酸外切酶突变体基于天然核酸外切酶进行突变产生，突变包括：(a)第58位甘氨酸G突变为半胱氨酸C；(b)第129位酪氨酸Y突变为谷氨酸E。本发明专利技术还提供了一种核酸外切酶突变体的核酸等温扩增反应体系，所述核酸等温扩增反应体系包含所述核酸外切酶突变体，本发明专利技术提供的核酸外切酶突变体，活性高，较现有技术而言明显加快了核酸体系等温扩增的效率，缩短了反应时间，提高了等温扩增体系的检测灵敏度，满足社区和家庭检测中速率高、成本低和操作便捷的需要。成本低和操作便捷的需要。成本低和操作便捷的需要。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸外切酶突变体及包含该突变体的核酸等温扩增反应体系


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种核酸外切酶突变体及包含该突变体的核酸等温扩增反应体系。

技术介绍

[0002]核酸外切酶(exonucleautomotive service engineers)在核酸水解酶中，是具有从分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶，可大致分为水解磷酸二酯键的3
′
端生成5
′‑
单核苷酸的酶，及水解5
′
端生成3
′‑
单核苷酸的酶。前者有蛇毒磷酸二酯酶及大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等；后者有脾脏磷酸二酯酶、嗜酸乳杆菌(Lac
‑
tobacillus acidophilus)核酸酶。这些酶中还可以区别出从分子链的3
′
末端或5
′
末端开始切断和对单链DNA或双链DNA具有特异作用的酶。
[0003]核酸扩增在基因克隆、基因表达以及基因检测中广泛应用。目前最经典、最成熟的核酸扩增方法是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)。聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
[0004]PCR是利用DNA在体外摄氏95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'
‑
3')的方向合成互补链，然后再升温到95℃解链DNA，如此循环40次以上。
[0005]基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。由于PCR的反应过程中对温度很敏感，仪器对温度的控制就必须非常精准，而且升温降温要速度快，对仪器的要求就很高，仪器自然就比较昂贵，市场上实时荧光定量PCR的仪器一般都在20万以上。另外，因为反应过程中要不断的升温降温，这些都需要时间，导致PCR反应一般都要1.5小时左右，时间比较长。
[0006]《DNA detection using recombination proteins,2006,PLoS Biol》,4(7)：1115
‑
1121，作者为Olaf Piepenburg 1等，这一篇论文中介绍了利用重组酶进行等温扩增的方法，主要步骤为：在40℃左右，依靠重组酶打开DNA双链，并引导单链DNA引物结合DNA模板，同时单链结合蛋白结合并稳定打开的单链DNA模板，然后在聚合酶的作用下扩增DNA。DNA解链、扩增反应都在40℃左右恒定的温度进行，不需要变温，所以设备成本大大下降。另外，依靠重组酶打开双链，并引导单链DNA引物结合到模板，然后聚合酶催化DNA扩增，在多酶的作用下，DNA扩增复制过程不需要温度变化，省去了调整温度的时间，15分钟左右就能合成所需要的DNA，DNA扩增复制的时间大大缩短，新冠病毒的大流行急需快速、低价及简便的核酸扩增及检测方法，快速等温扩增正好满足要求。
[0007]在重组酶等温扩增的实时监测中，需要引入带荧光基团和猝灭基团的核酸探针，以及在核酸双链合成时能够水解核酸探针而释放荧光基团的核酸外切酶。核酸外切酶的活
性越高，水解的荧光探针就越多，对核酸扩增的监测就越灵敏，核酸外切酶的活性对核酸等温扩增效率的监测至关重要。目前现有技术中，核酸等温扩增实时监测体系中的核酸外切酶通常都活性不高，从而影响核酸等温扩增实时监测的灵敏度。
[0008]因此，本领域亟需生产高活性的核酸外切酶及其核酸等温扩增反应体系，能显著提高核酸等温扩增实时监测的灵敏度，满足社区和家庭检测中，速率高、成本低和操作便捷的需要。

技术实现思路

[0009]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种核酸外切酶突变体，所述核酸外切酶突变体基于天然核酸外切酶进行突变产生，所述核酸外切酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有至少90％，优选至少93％，更优选至少95％，最优选至少98％相同的序列。
[0010]具体地，所述天然核酸外切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码所述核酸外切酶突变体的氨基酸序列为基于SEQ ID NO:2做突变改造获得。
[0011]具体地，所述突变包括：
[0012](a)天然核酸外切酶的第58位甘氨酸G突变为半胱氨酸C；
[0013](b)天然核酸外切酶的第129位酪氨酸Y突变为谷氨酸E。
[0014]具体地，包括以下步骤：
[0015](1)、获取天然核酸外切酶基因并进行基因改造，对第58位密码子进行突变，使第58位密码子编码的氨基酸由甘氨酸G突变为半胱氨酸C；
[0016](2)、对第129位密码子进行突变，使第129位密码子编码的氨基酸由酪氨酸Y突变为谷氨酸E；
[0017](3)、将基因改造后的核酸外切酶基因与质粒融合，构建重组载体，转化宿主细胞；
[0018](4)、诱导宿主细胞表达，分离纯化表达产物，得到核酸外切酶突变体。
[0019]优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0020]本专利技术还提供了一种核酸等温扩增的反应体系，包括核酸外切酶、Bst DNA聚合酶、单链结合蛋白、肌酸激酶、DNA模板和扩增引物，所述核酸外切酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有至少90％，优选至少93％，更优选至少95％，最优选至少98％相同的序列。
[0021]具体地，所述扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0022]本专利技术还提供了一种核酸等温扩增的检测体系，包括核酸等温扩增的反应体系和荧光探针，所述核酸等温扩增的反应体系为前述的核酸等温扩增的反应体系，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0023]具体地，所述荧光探针的荧光基团为FAM，所述荧光探针的淬灭基团为BHQ1。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0025]本专利技术提供的核酸外切酶突变体及核酸等温扩增反应体系，构建的核酸外切酶突变体实时监测核酸扩增检测体系，通过核酸外切酶突变体实时监测核酸等温扩增，显著提升了核酸等温扩增检测的灵敏度，能够更好的满足社区和家庭检测的需要，对于核酸检测
的临床应用具有现实意义。
附图说明
[0026]图1为在等温扩增复制核酸的体系中，本专利技术提供的核酸外切酶突变体和天然核酸外切酶检测核酸等温扩增的荧光值上升曲线对比图。
[0027]图中，横坐标为反应时间，纵坐标为相对荧光强度。曲线1为本专利技术提供的核酸外切酶突变体所在体系的荧光上升曲线，曲线2为天然核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸外切酶突变体，其特征在于，所述核酸外切酶突变体基于天然核酸外切酶进行突变产生，所述核酸外切酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有至少90％，优选至少93％，更优选至少95％，最优选至少98％相同的序列。2.根据权利要求1所述的核酸外切酶突变体，其特征在于，所述天然核酸外切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码所述核酸外切酶突变体的氨基酸序列为基于SEQ ID NO:2做突变改造获得。3.根据权利要求1所述的核酸外切酶突变体，其特征在于，所述突变包括：(a)天然核酸外切酶的第58位甘氨酸G突变为半胱氨酸C；(b)天然核酸外切酶的第129位酪氨酸Y突变为谷氨酸E。4.一种如权利要求1所述的核酸外切酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、获取天然核酸外切酶基因并进行基因改造，对第58位密码子进行突变，使第58位密码子编码的氨基酸由甘氨酸G突变为半胱氨酸C；(2)、对第129位密码子进行突变，使第129位密码子编码的氨基酸由酪氨酸Y突变为谷氨酸E；(3)、将基因改造后的核酸外切酶基因与质粒融合，构建重组载体，转化宿...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨挥，
申请(专利权)人：苏州青帆科技有限公司，
类型：发明
国别省市：