棕榈酰化17-十八碳烯酸点击化学试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了棕榈酰化17

【技术实现步骤摘要】
37℃预热的培养基中，使用0.22um滤膜除菌，培养细胞4小时，使用磷酸盐缓冲液洗两次，离心取细胞；
[0019]S02、每管加入190ul的第二溶液，10ul 0.1M的PMSF裂解细胞，300瓦功率下超声破碎，循环超声5s且停5秒，持续2分钟；12000g离心5min取上清，使用BCA法侧蛋白浓度，并取400ug的蛋白到1.5ml管里；
[0020]S03、将第二溶液补足体积至185ul，加入10ul的第三溶液，室温翻转30min，加入5ul第四溶液，室温翻转2h；
[0021]S04、加入600ul的甲醇，150ul的氯仿，400ul的二次蒸馏水，涡旋混匀，13000rpm离心5分钟，取中间层加入450ul的甲醇，13000rpm离心5min，去除上清，风干2
‑
3min；
[0022]S05、加入185ul的第二溶液，10ul的第三溶液，室温翻转30min，加入5ul的第四溶液，室温翻转2h；
[0023]S06、重复步骤S04两次，第一次沉淀用200ul的第二溶液溶解，第二次沉淀进入步骤S07操作；
[0024]S07、加入15ul第二溶液打散蛋白，加入135ul二次蒸馏水，混匀溶解，加入50ul第五溶液，室温翻转2h，加入4ul 0.5M的乙二胺四乙酸(EDTA)震荡混匀；
[0025]S08、重复步骤S04一次，沉淀加入15ul第二溶液吸打蛋白混匀，加入400ul第六溶液溶解蛋白；
[0026]S09、组装好离心柱，取掉离心柱底部红色塞子，加入100ul第六溶液清洗离心柱1次，掌上离心机轻甩，弃去液体；取50ul第七溶液至离心柱中，取之前充分混匀；用第六溶液清洗离心柱两次，每次200ul，掌上离心机轻甩，塞好离心柱底部塞子，在离心柱中加入溶解好的400ul蛋白样品，翻转2h；
[0027]S10、取掉离心柱底部的塞子，用第八溶液清洗离心柱5次，每次200ul，掌上离心机轻甩，弃去液体，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗离心柱5次，每次200ul，掌上离心机轻甩，弃去液体，将离心柱装入新的1.5ml离心管中；
[0028]S11、加入100ul第九溶液37℃震荡30分钟，掌上离心机轻甩，收集滤液，滤液中加入10ul第十溶液避光反应40分钟，低温送至MS检测中心加测；或加入蛋白上样缓冲液(loading buffer)95℃加热5分钟，用于WB检测，抗体需用所检蛋白的特性新抗体。
[0029]本专利技术相对于现有技术包括有以下有益效果：
[0030]本技术方案的棕榈酰化17
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十八碳烯酸点击化学试剂盒能够缩短实验时间，将原来用两天实现的检测，现在仅需一天，减少了蛋白的降解，利用兼容WB检测及质谱的检测方法，能够使结果更可信，降低了蛋白损耗，相对于普通方法能够富集到更多的肽段，且能够分析得到更多棕榈酰化修饰蛋白，提高了灵敏度。
[0031]当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
[0032]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033]图1为使用本专利技术的棕榈酰化17
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十八碳烯酸点击化学试剂盒与未使用本技术方案的试剂盒于质谱仪下基于一种序列下显示的质谱图；
[0034]图2为使用本专利技术的棕榈酰化17
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十八碳烯酸点击化学试剂盒与未使用本技术方案的试剂盒于质谱仪下基于另一种序列下显示的质谱图；
[0035]图3是将本试剂盒处理后与常规方法处理后送至MS检测中心加测后的比对图片；
[0036]图4为本试剂盒的处理组与对照组进行检测后的成像图。
具体实施方式
[0037]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0038]本专利技术的棕榈酰化17
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十八碳烯酸点击化学试剂盒，包括:
[0039]第一溶液：50mM的17
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十八碳烯酸alk
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16(alkyne
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tagged analogue of palmitic acid，炔烃标记的棕榈酸类似物)溶于10ml二甲基亚砜(DMSO)中；
[0040]第二溶液：为LB裂解液，由4％的十二烷基硫酸钠(SDS)、150mM的氯化钠(NaCL)、50mM的4
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羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、核酸酶、无乙二胺四乙酸(EDTA)的蛋白酶抑制剂构成，所述4
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羟乙基哌嗪乙磺酸ph为7.4；
[0041]第三溶液：为200mM的三(2
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羧乙基)膦(TCEP)；
[0042]第四溶液：为0.5M的乙基马来酰亚胺(NEM)；
[0043]第五溶液：为点击化学反应液(CUAAC反应液)，由2ul10mM的叠氮生物素(azido
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Biotin)、4ul 50mM的硫酸铜(CuSO4)、4ul 50mM的三(2
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羧乙基)膦(TCEP)、10ul 2mM的叔丁基三氯乙酰亚胺酯(TBTA)构成；
[0044]第六溶液：为平衡液，由含有2％十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液(PBS)构成；
[0045]第七溶液：为琼脂糖凝胶珠(Agarose)；
[0046]第八溶液：为清洗液，由含有0.5％十二烷基硫酸钠的磷酸盐缓冲液构成；
[0047]第九溶液：为1M的盐酸羟胺(HA)；
[0048]第十溶液：为250mM的碘乙酰胺(IAA)；
[0049]除了上述溶液外，还需用到的试剂包括0.1M PMSF，甲醇，氯仿，二次蒸馏水(ddH2O)，0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)，4M尿素，磷酸盐缓冲液(PBS)，蛋白上样缓冲液(loading buffer)。
[0050]棕榈酰化17
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十八碳烯酸点击化学试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0051]S01、将细胞培养24h后，取12ul的第一溶液与实验所用的药物混合后(对照组采用二甲基亚砜(DMSO)替代)，加入12ml 37℃预热的培养基中，使用0.22um滤膜除菌，培养细胞4小时，使用磷酸盐缓冲液洗两次，离心取细胞；
[0052]S02、每管加入190ul的第二溶液，10ul 0.1M的PMSF裂解细胞，300瓦功率下超声破碎，循环超声5s且停5秒，持续2分钟；12000g离心5min取上清，使用BCA法侧蛋白浓度，并取400ug的蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.棕榈酰化17
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十八碳烯酸点击化学试剂盒，其特征在于，包括：第一溶液：50mM的17
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十八碳烯酸溶于10ml二甲基亚砜中；第二溶液：为LB裂解液，由4％的十二烷基硫酸钠、150mM的氯化钠、50mM的4
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羟乙基哌嗪乙磺酸、核酸酶、无乙二胺四乙酸的蛋白酶抑制剂构成，所述4
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羟乙基哌嗪乙磺酸ph为7.4；第三溶液：为200mM的三(2
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羧乙基)膦；第四溶液：为0.5M的乙基马来酰亚胺；第五溶液：为点击化学反应液，由2ul10mM的叠氮生物素、4ul 50mM的硫酸铜、4ul 50mM的三(2
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羧乙基)膦、10ul 2mM的叔丁基三氯乙酰亚胺酯构成；第六溶液：为平衡液，由含有2％十二烷基硫酸钠的磷酸盐缓冲液构成；第七溶液：为琼脂糖凝胶珠；第八溶液：为清洗液，由含有0.5％十二烷基硫酸钠的磷酸盐缓冲液构成；第九溶液：为1M的盐酸羟胺；第十溶液：为250mM的碘乙酰胺。2.根据权利要求1所述的棕榈酰化17
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十八碳烯酸点击化学试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：S01、将细胞培养24h后，取12ul的第一溶液与实验所用的药物混合后，加入12ml 37℃预热的培养基中，使用0.22um滤膜除菌，培养细胞4小时，使用磷酸盐缓冲液洗两次，离心取细胞；S02、每管加入190ul的第二溶液，10ul 0.1M的PMSF裂解细胞，300瓦功率下超声破碎，循环超声5s且停5秒，持续2分钟；12000g离心5min取上清，使用BCA法侧蛋白浓度，并取400ug的蛋白到1.5ml管里；S03、将第二溶液补足体积至185...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵淑娟，崔蕴博，
申请(专利权)人：苏州柯茂生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：