转氨酶及用于制备西他列汀或其中间体的用途制造技术

本发明专利技术提供了一种转氨酶及用于制备西他列汀或其中间体的用途。所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含一个、两个或三个的残基位置处的氨基酸残基差异。本发明专利技术还提供了一种编码所述转氨酶的核酸、包括所述核酸的重组表达载体和包含所述核酸或重组表达载体的转化体以及它们的应用。本发明专利技术还提供了一种包含所述转氨酶的酶制剂或所述转氨酶的组合。本发明专利技术还提供了一种制备(R)

【技术实现步骤摘要】
转氨酶及用于制备西他列汀或其中间体的用途


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种转氨酶、该转氨酶用于制备西他列汀或其中间体的用途，以及一种西他列汀或其中间体(R)
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氨基
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吗啉
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(2,4,5
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三氟苯基)
‑1‑
丁酮的制备方法。

技术介绍

[0002]糖尿病是由于胰岛素分泌改变，导致胰岛素缺乏及作用减弱，或者胰岛素活性降低，或者在两者共同影响下，出现的代谢性疾病，以高血糖为特征，并同时伴有蛋白质、糖及脂肪的代谢紊乱。糖尿病及其并发症对人类健康的危害程度居心血管疾病、肿瘤之后的第三位，成为危害人类健康的重要疾病。在糖尿病的四种类型中，II型糖尿病占90％以上，多见于30岁以上的中老年人，病因主要是由于机体对胰岛素不敏感。
[0003]西他列汀磷酸盐(Sitagliptin phosphate)是2006年FDA批准上市的第一个二肽基酶
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IV(DPP
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4)抑制剂，用于治疗II型糖尿病。其单用或与二甲双胍、吡格列酮合用都有明显的降血糖作用，且服用安全，耐受性好，不良反应少。
[0004]WO2019011236A1中报道了1
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吗啉
‑4‑
(2,4,5
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三氟苯基)
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1,3
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丁二酮(本专利技术中又简称为吗啉双酮)可以经转氨酶(transaminase)催化制得(R)
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氨基
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吗啉
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(2,4,5
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三氟苯基)
‑1‑
丁酮，(R)
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氨基
‑1‑
吗啉
‑4‑
(2,4,5
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三氟苯基)
‑1‑
丁酮可以进一步得到Boc
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(R)
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氨基
‑4‑
(2,4,5
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三氟苯基)丁酸(简称西他列汀
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Boc丁酸)，西他列汀
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Boc丁酸再经反应制得西他列汀磷酸盐，但是反应中酶活还需要进一步提高。
[0005]
技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中将转氨酶催化吗啉双酮底物以生产西他列汀中间体或西他列汀时转化率不高等缺陷，提供了一种转氨酶及其用于制备西他列汀中间体或其西他列汀的用途。将本专利技术的转氨酶用于催化吗啉双酮底物以生产西他列汀中间体或西他列汀时转化率高、稳定性好，进而降低了生产成本，有利于工业化生产。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供了一种转氨酶，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下一个、两个或三个的残基位置处的氨基酸残基差异：
[0008]第150位氨基酸残基为A、L、Q、V、W、T、E或C；
[0009]第152位氨基酸残基为A、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V或Y；
[0010]第155位氨基酸残基为A、K、N或R。
[0011]换言之，所述转氨酶与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有S150A/L/Q/V/W/T/E/C、C152A/H/I/K/L/M/N/Q/S/T/V/Y和/或Q155A/K/N/R的改变。本专利技术中，所述改变不一定需要在SEQ ID NO:1的基础上进行突变，只要转氨酶最终实现与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有S150A/L/Q/V/W/T/E/C、C152A/H/I/K/L/M/N/Q/S/T/V/Y和/或Q155A/K/N/Q/R的氨基酸差异，则同样落入本专利技术保护的范围。
[0012]在一些实施方案中，转氨酶的氨基酸序列可在上述的特定位置以外的位置另外具有1
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2、1
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3、1
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4、1
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5、1
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20个氨基酸残基的差异；这些残基的差异包括以保守氨基酸残基取代。通常这些取代不影响所述转氨酶的酶活。
[0013]在一些实施方案中，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下两个的残基位置处的氨基酸残基差异：第150位氨基酸残基为A、L、Q、V或W；第152位氨基酸残基为L、Q、T、A或S；第155位氨基酸残基为A或R。
[0014]在一些实施方案中，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下三个的残基位置处的氨基酸残基差异：第150位氨基酸残基为A、V、W、T、E或C；第152位氨基酸残基为H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V或Y；第155位氨基酸残基为A、K、N或R。
[0015]在一些优选的实施方案中，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下两个的残基位置处的氨基酸残基差异：第150位氨基酸残基为A、L、V或W；第152位氨基酸残基为L、T、A或S。
[0016]在一些优选的实施方案中，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下两个的残基位置处的氨基酸残基差异：第150位氨基酸残基为Q或V；第155位氨基酸残基为A或R。
[0017]在一些优选的实施方案中，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下两个的残基位置处的氨基酸残基差异：第152位氨基酸残基为L或Q；第155位氨基酸残基为R。
[0018]在一些更优选实施方案中，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下组的氨基酸残基差异，如下表格所示：
[0019][0020][0021]在一些进一步更优选实施方案中，编码所述转氨酶的核苷酸序列与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列相比包含选自以下组的核苷酸差异，如下表格所示：
[0022][0023][0024][0025]上表中，152CTG表示编码第152位氨基酸残基的密码子由TGC替换为CTG，155CGT表示编码第155位氨基酸残基的密码子由CAA替换为CGT，150ACC表示编码第150位氨基酸残基的密码子由AGT替换为ACC，在本表中其他的氨基酸残基密码子的替换表示方式与之类似。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下一个、两个或三个的残基位置处的氨基酸残基差异：第150位氨基酸残基为A、L、Q、V、W、T、E或C；第152位氨基酸残基为A、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V或Y；第155位氨基酸残基为A、K、N或R。2.如权利要求1所述的转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下两个的残基位置处的氨基酸残基差异：第150位氨基酸残基为A、L、Q、V或W；第152位氨基酸残基为A、L、Q、T或S；第155位氨基酸残基为A或R；或者，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下三个的残基位置处的氨基酸残基差异：第150位氨基酸残基为A、V、W、T、E或C；第152位氨基酸残基为H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V或Y；第155位氨基酸残基为A、K、N或R。3.如权利要求1或2所述的转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下两个的残基位置处的氨基酸残基差异：第150位氨基酸残基为A、L、V或W；第152位氨基酸残基为A、L、T或S；或者，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下两个的残基位置处的氨基酸残基差异：第150位氨基酸残基为Q或V；第155位氨基酸残基为A或R；或者，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下两个的残基位置处的氨基酸残基差异：第152位氨基酸残基为L或Q；第155位氨基酸残基为R。4.如权利要求1或2所述的转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含选自以下组的氨基酸残基差异，如下表格所示：
较佳地，编码所述转氨酶的核苷酸序列与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列相比包含选自以下组的核苷酸差异，如下表格所示：
5.一种分离的核酸，其编码如权利要求1
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4任一项所述的转氨酶。6.一种重组表达载体，其包括如权利要求5所述的分离的核酸；较佳地，所述重组表达载体的骨架为质粒pET21a。7.一种转化体，其为在宿主中导入如权利要求5所述的分离的核酸或者如权利要求6所述的重组表达载体；较佳地，所述宿主为大肠杆菌；例如大肠杆菌BL21。8.一种制备如权利要求1
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4任一项所述的转氨酶的方法，其特征在于，所述方法包括在适于表达所述转氨酶的条件下培养如权利要求7所述的转化体。9.一种酶制剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：田振华，王舒，焦琦，徐晓岚，程占冰，
申请(专利权)人：弈柯莱生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：