光学活性氨基酰胺化合物的对映选择性化学酶合成制造技术

本发明专利技术涉及通过NHase酶催化来立体选择性制备α氨基酰胺化合物的新型生物催化方法。发明专利技术的另一方面涉及新型NHase酶以及进一步改善的NHase酶突变体、编码这些酶的核酸分子、适合制备这类酶及突变体的重组微生物。本发明专利技术的另一方面涉及制备内酰胺化合物的化学生物催化方法，其包括通过NHase酶催化来制备α氨基酰胺化合物的新催化方法，以及通过应用某些化学氧化催化剂的α氨基酰胺化学氧化，所述催化剂适合在保留其立体化学构型下将α氨基酰胺转变成相应的内酰胺。新型化学生物催化方法特别适合有价值药物化合物的合成，例如尤其是(S)

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】光学活性氨基酰胺化合物的对映选择性化学酶合成


[0001]本专利技术涉及通过NHase酶催化来立体选择性制备α氨基酰胺化合物的新型生物催化方法。专利技术的另一方面涉及新型NHase酶以及进一步改善的NHase酶突变体、编码这些酶的核酸分子、适合制备这类酶及突变体的重组微生物。专利技术的另一方面涉及制备内酰胺化合物的化学生物催化方法，其包括通过NHase酶催化来制备α氨基酰胺化合物的新催化方法，以及通过应用某些化学氧化催化剂的α氨基酰胺化学氧化，所述催化剂适合在保留其立体化学构型下将α氨基酰胺转变成相应的内酰胺。新型化学生物催化方法特别适合有价值药物化合物的合成，例如尤其是(S)
‑
左乙拉西坦。

技术介绍

[0002]腈水合酶(NHase；EC 4.2.1.84)催化腈水合作用成相应的酰胺[S.Prasad,T.C.Bhalla,Nitrile hydratases(NHases):At the interface of academia and industry,Biotechnol.Adv.28(2010)725
–
741]。能区分两种类型的NHase，即非含咕啉钴和非含血红素铁的NHase。这两种都由α
‑
和β
‑
亚基构成，并且功能性异源表达取决于辅助蛋白的作用[E.T.Yukl,C.M.Wilmot,Cofactor biosynthesis through protein post
‑
translational modification,Curr.Opin.Chem.Biol.16(2012)54
–
59.]。
[0003]成功的异源表达已有描述：NHase，来自产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)[F.
‑
M.Guo,J.
‑
P.Wu,L.
‑
R.Yang,G.Xu,Overexpression of a nitrile hydratase from Klebsiella oxytoca KCTC 1686in Escherichia coli and its biochemical characterization,Biotechnol.Bioprocess Eng.20(2015)995
–
1004]和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)RAPc[R.A.Cameron,M.Sayed,D.A.Cowan,Molecular analysis of the nitrile catabolism operon of the thermophile Bacillus pallidus RAPc8,Biochim.Biophys.Acta.1725(2005)35
–
46]，以及热稳定NHase，来自嗜热假单胞菌(Pseudomonas thermophile)[A.Miyanaga,S.Fushinobu,K.Ito,T.Wakagi,Crystal Structure of Cobalt
‑
Containing Nitrile Hydratase,Biochem.Biophys.Res.Commun.288(2001)1169
–
1174]和橙色单胞菌(Aurantimonas manganoxydans)[X.Pei,H.Zhang,L.Meng,G.Xu,L.Yang,J.Wu,Efficient cloning and expression of a thermostable nitrile hydratase in Escherichia coli using an auto
‑
induction fed
‑
batch strategy,Process Biochem.48(2013)1921
–
1927]。Pei等人还在其中描述了如果来自橙色单胞菌(M.manganoxydans)的NHase在大肠杆菌中与伴侣蛋白GroEL/ES或DnaK/J
‑
GrpE共表达，则所表达蛋白以显著更高收率获得。
[0004]在文献中，已经描述了来自不同生物体的对映选择性NHase，如嗜碱硝化菌(Nitriliruptor alkaliphilus)、大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)[S.Wu,R.D.Fallon,M.S.Payne,Over
‑
production of stereoselective nitrile hydratase from Pseudomonas putida 5B in Escherichia coli:activity requires a novel downstream protein,
Appl.Microbiol.Biotechnol.48(1997)704
–
708；J.L.Tucker,L.Xu,W.Yu,R.W.Scott,L.Zao,N.Ran,Chemoenzymatic processes for preparation of Levetiracetam,WO2009009117,2009；S.van Pelt,M.Zhang,L.G.Otten,J.Holt,D.Y.Sorokin,F.van Rantwijk,G.W.Black,J.J.Perry,R.A.Sheldon,Probing the enantioselectivity of a diverse group of purified cobalt
‑
centred nitrile hydratases,Org.Biomol.Chem.9(2011)3011]。
[0005](S)
‑
选择性腈水合酶已经描述于WO2009009117的左乙拉西坦(3)生成的上下文中，然而，在外消旋2
‑
(2
‑
氧代吡咯烷
‑1‑
基)
‑
丁腈(7)的经典酶动力学拆分(EKR)中，
[0006][0007]仅导致最高50％的理论收率(4)。
[0008]本专利技术解决的第一个问题是提供新型合成方法，允许生成左乙拉西坦(4)和相关内酰胺，尤其是收率提高。
[0009]本专利技术解决的另一个问题是发现(S)
‑
选择性NHase能够使用2
‑
(2
‑
吡咯烷
‑1‑
基)
‑
丁腈(1)，尤其是(S)
‑
1作为底物。
[0010]本专利技术解决的另一个问题是发现稳健的(S)
‑
选择性NHase，以用于这类新方法。
[0011]本专利技术仍解决的另一个问本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备通式I的α氨基酰胺的生物催化方法其中n是0或1
‑
4的整数；并且R1和R2各自独立代表H或者直链或支链，饱和或不饱和的烃基，所述烃基具有1
‑
6个碳原子；特别是H或C1‑
C6烷基或C1‑
C3烷基；任选地基本上为立体异构纯形式或作为立体异构体的混合物；特别是基本上为立体异构纯形式，所述方法包括1)使通式II的α氨基腈与具有腈水合酶(NHase)活性的多肽接触，其中，n、R1和R2如上所定义，从而将所述通式II的腈化合物转化成所述通式I的化合物；以及2)任选地分离式I的化合物，其中应用式II的腈，其中n和R1如上所定义并且R2代表直链或支链，饱和或不饱和的烃基，所述烃基具有1
‑
6个碳原子，特别是C1‑
C6或C1‑
C3烷基。2.权利要求1的方法，其中应用通式IIa的腈，所述通式IIa的腈包含在氰基α位置的不对称碳原子，并且其中n和R1如上所定义，并且
R2代表直链或支链，饱和或不饱和的烃基，所述烃基具有1
‑
6个碳原子，特别是C1‑
C6或C1‑
C3烷基，其中所述腈以立体异构体的混合物形式应用，特别是在氰基α位置碳原子处包含(S)
‑
或(R)
‑
构型的异构体的混合物，并且其中所述立体异构混合物经由动态动力学拆分转化成反应产物，所述反应产物含有立体异构过量的式Ia化合物或式Ib化合物其中n、R1和R2如上所定义。3.权利要求2的方法，其中获得反应产物，所述反应产物包含立体异构过量的式XIa化合物或式XIb化合物4.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤1)在分离的、富集的或粗NHase酶的存在下，或在功能性表达所述酶的重组微生物或者从其获得的破裂细胞或细胞匀浆的存在下进行。5.权利要求4的方法，其中所述NHase是(S)
‑
NHase并且选自以下酶：a)CtNHase，其包含根据SEQ ID NO:15或与SEQ ID NO:15具有至少50％序列相同性的序列的α多肽亚基，以及根据SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少50％序列相同性的序列的β多肽亚基，同时保留(S)
‑
NHase活性；b)KoNHase，其包含根据SEQ ID NO:17或与SEQ ID NO:17具有至少50％序列相同性的序列的α多肽亚基，以及根据SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少50％序列相同性的序列的β多肽亚基，同时保留(S)
‑
NHase活性；c)NaNHase，其包含根据SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:19具有至少50％序列相同性的序列的α多肽亚基，以及根据SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有至少50％序列相同性的序列的β多肽亚基，同时保留(S)
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NHase活性；d)GhNHase，其包含根据SEQ ID NO:21或与SEQ ID NO:21具有至少50％序列相同性的序列的α多肽亚基，以及根据SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8具有至少50％序列相同性的序列的β多肽亚基，同时保留(S)
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NHase活性；
e)PkNHase，其包含根据SEQ ID NO:27或与SEQ ID NO:27具有至少50％序列相同性的序列的α多肽亚基，以及包含根据SEQ ID NO:13的部分多肽序列或与SEQ ID NO:13的所述部分序列具有至少50％序列相同性的序列的β多肽亚基，同时保留(S)
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NHase活性；f)PmNHase，其包含根据SEQ ID NO:23或与SEQ ID NO:23具有至少50％序列相同性的序列的α多肽亚基，以及根据SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10具有至少50％序列相同性的序列的β多肽亚基，同时保留(S)
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NHase活性；和g)ReNHase，其包含根据SEQ ID NO:25或与SEQ ID NO:25具有至少50％序列相同性的序列的α多肽亚基，以及根据SEQ ID NO:12或与SEQ ID NO:12具有至少50％序列相同性的序列的β多肽亚基，同时保留(S)
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NHase活性。6.权利要求5的方法，其中所述(S)
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NHase选自CtNHase突变体，在所述突变体根据SEQ ID NO:15的α多肽亚基中含有至少一个氨基酸突变，和/或在所述突变体根据SEQ ID NO:2的β多肽亚基中含有至少一个氨基酸突变，同时保留(S)
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NHase活性。7.权利要求6的方法，其中所述CtNHase突变体选自这样的突变体：在其根据SEQ ID NO:15的α多肽亚基中具有至少一个在序列位置中的突变(特别是氨基酸取代)，所述序列位置选自α序列位置αA71X、αK73X、αD79X、αT81X、αL87X、αG94X、αV98X、αE101X、αN102X、αT103X、αA105X、αV106X、αV110X；αP121X、αG124X、αY135X、αV140X、αL147X、V153X、αA156X、αL173X、αP174X；特别是αV110X和αP121X，其中X选自天然氨基酸；和/或在其根据SEQ ID NO:2的β多肽亚基中具有至少一个在序列位置中的突变(氨基酸取代)，所述序列位置选自β序列位置βT32X、βV33X、βM34X、βS35X、βL36X、βL40X、βA42X、βN43X、βN45X、βF46X、βN47X、βL48X、βE50X、βF51X、βR52X、βH53X、βG54X、βE56X、βR57X、βN59X、βI61X、βD62X、βL64X、βK65X、βG66X、βT67X、βE70X；βG125X、βA126X、βR127X、βA128X、βR129X、βA131X、βV132X、βG133X、βV136X、βR137X、βK141X、βP143X、βV144X、βG145X、βH146X、βP150X、βY152X、βT153X、βG155X、βK156X、βV157X、βT159X、βI162X、βH164X、βG165X、βV166X、βF167X、βV168X、βT169X、βP170X；特别是βL48X、βF51X、βG54X、βH146X和βF167X，其中X选自天然氨基酸。8.权利要求7的方法，其中所述CtNHase突变体选自：a)单突变体：βF51L、βF51I、βF51V、βL48R和βL48P；b)双突变体：αV110I/βF51L、αP121T/βF51L、βF51V/βG54V、
βF51V/βG54I、βF51V/βG54R、βF51I/βG54R、βN43I/βG54C、βF51I/βE70L、βH53L/βG54V、αV110I/βL48R、αV110I/βL48P、αV110I/βL48F、αP121T/βL48R、αP121T/βL48P、αP121T/βL48F、βH146L/βF167Y、βL48R/βG54C、βL48R/βG54R、βL48R/βG54V、βL48P/βG54C、βL48P/βG54R、βL48P/βG54V、βL48F/βG54C、βL48F/βG54R、和βL48F/βG54V；特别是αV110I/βF51L、αP121T/βF51L、βF51V/βG54V、βN43I/βG54C、βF51I/βE70L、βH53L/βG54V、αP121T/βL48R、βH146L/βF167Y和βL48R/βG54V；c)三突变体βF51L/βH146L/βF167Y、βL48R/βH146L/βF167Y、βL48P/βH146L/βF167Y、βL48F/βH146L/βF167Y、αV110I/βF51V/βG54I、αP121T/βF51V/βG54I、βL48P/βF51V/βG54V、和
βL48R/βF51I/βG54I以及d)多重突变体：βF51I/βG54R/βH146L/βF167Y、βF51V/βG54I/βH146L/βF167Y、βF51V/βG54R/βH146L/βF167Y、βF51V/βG54V/βH146L/βF167Y、αV110I/αP121T/βF51I/βH146L/βF167Y、αV110I/αP121T/βF51L/βH146L/βF167Y。9.一种分离的(S)
‑
NHase酶，其选自KoNHase，...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：细胞制药有限公司，
类型：发明
国别省市：