一种亚胺还原酶突变体及其应用和应用方法技术

本发明专利技术属于生物催化有机合成技术领域，特别涉及一种亚胺还原酶突变体及其应用和应用方法。本发明专利技术是在亚胺还原酶突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列上发生突变的氨基酸序列，可选的突变点位包括下列点位之一：第44位G突变为V或第89位L突变为V或第44位G与第89位L同时突变为V。本发明专利技术亚胺还原酶突变体结合葡萄糖脱氢酶，以β

【技术实现步骤摘要】
一种亚胺还原酶突变体及其应用和应用方法


[0001]本专利技术属于生物催化有机合成
，特别涉及一种亚胺还原酶突变体及其应用和应用方法。

技术介绍

[0002]神经退行性疾病是对人类健康的重大威胁之一，随着对这类疾病研究的不断深入，有学者认为神经原中的尼古丁乙酰胆碱受体(nAChR)是药物治疗的重要靶点(Neuropharmacology,1995,34,563)。许多研究已证实天然生物碱尼古丁对于帕金森症、阿尔茨海默氏症(Alzheimer)和抽动秽语综合征症(Tourette)均有一定的缓解和治疗作用，然而其本身对心血管系统和消化系统具有毒副作用，大大限制了它的临床应用(Chem Eng.News 2000,78,23
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26)。现有文献(J.Med.Chem.1997,40,4169；J.Pharm.Exp.Ther.2000,292,461)通过系统研究总结了nachr配体的构效关系，早在二十世纪末也已经发现了一些新型的尼古丁类似物，并用于临床治疗帕金森症(j.org.chem.1999，64，5299)。Dukat等(Eur.J.Med.Chem.1999,34,31)总结报道了取代尼古丁与nAChR受体亲和力与6位取代基的亲脂性有关，相关研究进一步表明，随着取代基的大小增加，亲和力下降，也就是说，尼古丁类似物的亲和力由6位取代基的亲脂性决定，同时也与取代基的大小有关。其中，6
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甲基尼古丁的6位取代基体积最小，亲脂性强，与nAChR受体也有强亲和力，有着很好的药用前景。现有技术基本都是集中在消旋体合成，暂无单一构型合成相关报道。
[0003]寻找不同生物来源的亚胺还原酶，并借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造获得更加高效的亚胺还原酶，是实现烟碱关键手性中间体(S)
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甲基
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(吡咯
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基)吡啶酶法工业化生产的努力方向。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是一种亚胺还原酶突变体，该突变体可将5
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(3,4
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二氢
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2H
‑
吡咯
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基)
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甲基吡啶还原加氢并转化成单一手性中间体(S)
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甲基
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(吡咯
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基)吡啶，其中化学转化率可达99.5％以上，e.e.％可以达到99.6％，为(S)
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2甲基
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(1
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甲基吡咯
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基)吡啶的工业化奠定了生产基础，具有良好的工业应用价值。
[0005]本专利技术是通过在氨基酸序列SEQ NO.1所示、其核苷酸序列SEQ NO.5所示的野生型亚胺还原酶基础上，采用随机突变的分子生物学方法对亚胺还原酶进行突变，从而改变酶的氨基酸序列，实现酶结构和功能的改变，再通过定向筛选的办法，得到在SEQ NO.1氨基酸基础上第44位G突变为V或第89位L突变为V或第44位G与第89位L同时突变为V的3种亚胺还原酶突变体。
[0006]具体的，本专利技术的亚胺还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ NO.2、SEQ NO.3或SEQ NO.4所示。
[0007]具体的，本专利技术的亚胺还原酶突变体SEQ NO.2的核苷酸序列如SEQ NO.6所示。
[0008]具体的，本专利技术的亚胺还原酶突变体SEQ NO.3的核苷酸序列如SEQ NO.7所示。
[0009]具体的，本专利技术的亚胺还原酶突变体SEQ NO.4的核苷酸序列如SEQ NO.8所示。
[0010]本专利技术还提供了一种包含有上述氨基酸序列如SEQ NO.2、SEQ NO.3或SEQ NO.4所述亚胺还原酶突变体的编码基因的重组质粒。
[0011]本专利技术还提供了包含上述重组质粒的宿主细胞。所述宿主细胞选自原核细胞或真核细胞，所述原核细胞为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
[0012]本专利技术还提供上述亚胺还原酶突变体在合成中间体(S)
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甲基
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(吡咯
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基)吡啶中的应用。
[0013]应用方法为：将亚胺还原酶突变体结合葡萄糖脱氢酶，以β
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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐为辅酶，以5
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(3,4
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二氢
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2H
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吡咯
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基)
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甲基吡啶为底物，不对称加氢还原制备中间体(S)
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甲基
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(吡咯
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基)吡啶。
[0014]优选的，所述亚胺还原酶突变体制备中间体(S)
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甲基
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(吡咯
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基)吡啶反应过程的pH值为6.8～8.0；
[0015]进一步优选的，所述pH值为7.2～7.6，用质量浓度为8％氢氧化钠水溶液作为pH调节剂，来调整反应过程中pH值。反应过程中pH值低于6.8或者高于8.0，反应转化率和反应速度明显降低。
[0016]优选的，所述亚胺还原酶突变体制备中间体(S)
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甲基
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(吡咯
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基)吡啶反应过程反应温度控制在15～35℃；
[0017]进一步优选的，所述反应温度范围为25～30℃，温度低于15℃或者高于35℃，反应转化率和反应速度明显降低。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0019]1)采用本专利技术的亚胺还原酶突变体用于催化5
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(3,4
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二氢
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2H
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吡咯
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基)
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甲基吡啶不对称加氢还原，相比野生型亚胺还原酶，其酶活性提高10倍以上，具有非常高的化学转化率和立体选择性。
[0020]2)采用本专利技术的亚胺还原酶突变体在制备中间体(S)
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甲基
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(吡咯
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基)吡啶的应用中，其中化学转化率可达99.5％以上，e.e.％可以达到99.6％，为(S)
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2甲基
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(1
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甲基吡咯
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基)吡啶的工业化奠定了生产基础，具有良好的工业应用价值。
具体实施方式
[0021]下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。
[0022]实施例1：获得Actinomadura sp.CNU
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125(马杜拉放线菌)菌株的野生型亚胺还原酶母本重组质粒子：
[0023]通过NCBI Genbank核酸数据库，经密码子优化并委托服务商人工合成全长基因至pET21a(+)表达质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亚胺还原酶突变体，所述亚胺还原酶突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列上发生突变的氨基酸序列，可选的突变点位包括下列点位之一：第44位G突变为V或第89位L突变为V或第44位G与第89位L同时突变为V。2.根据权利要求1所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求1所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。5.一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求1所述的亚胺还原酶突变体的编码基因。6.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求5所述的重组质粒。7.如权利要求1所述的亚胺还原酶突变体在合成中间体(S)
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甲基
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(吡咯
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基)吡啶中的应用。8.一种亚胺还原酶突变体在合成中间体(S)
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甲基
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(吡咯
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基)吡啶中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亚君，胡永伟，
申请(专利权)人：浙江安诺和生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：