一种酮基还原酶突变体及其制备方法、应用和艾司利卡西平的制备方法技术

本发明专利技术提供一种酮基还原酶突变体及其制备方法、应用和艾司利卡西平的制备方法，所述酮基还原酶突变体为发生了氨基酸突变的酮基还原酶，所述酮基还原酶包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述氨基酸突变的类型包括D77S、P195Y、D207F、D77S/P195Y、P195Y/D207F、D77S/D207F或D77S/P195Y/D207F。本发明专利技术的酮基还原酶突变体与原始酮基还原酶相比，酶活得到明显增强，酶促反应所需时间大大缩短，提高了反应特异性，转化率和产物的光学纯度大幅提升，且酶的底物耐受能力更高，能够在高浓度底物水平下进行反应，实现了奥卡西平向艾司利卡西平的高效转化，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种酮基还原酶突变体及其制备方法、应用和艾司利卡西平的制备方法


[0001]本专利技术属于蛋白改造
，尤其涉及一种酮基还原酶突变体及其制备方法、应用和艾司利卡西平的制备方法。

技术介绍

[0002]艾司利卡西平(S
‑
利卡西平，(S)
‑
10
‑
hydroxy
‑
10,11
‑
dihydro
‑
5H
‑
dibenzo[b,f]axepine
‑5‑
carboxamide)是一种新型的抗癫痫药物，可阻断电压门控钠通道活性，抑制脑部神经的异常放电，是醋酸艾司利卡西平(商品名Aptiom)的前体物，也是现有治疗药物奥卡西平在体内的主要活性代谢产物。
[0003]奥卡西平在体内可代谢为S
‑
利卡西平和R
‑
立卡西平两种异构体，其中S
‑
异构体比R
‑
利卡西平的不良反应更轻微，且治疗效果更好，S
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利卡西平可以更有效地穿过血脑屏障。因此，后续开发出可有效释放S
‑
利卡西平的艾司利卡西平醋酸酯前体药物，它可以在消化道中被有效吸收，并水解作用代谢为S
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利卡西平，与奥卡西平相比其机体耐受性更好。
[0004]现有文献报道的艾司利卡西平的制备方法主要分为两类，一类是化学催化法，其是使用各类催化物及氢供体还原生成艾司利卡西平，但反应过程中常常需要使用到一些昂贵的催化试剂，整体成本较高，反应路线长，最终产品难以保证较高的收率；另外，反应过程中使用的多种有机试剂，造成后处理困难，难以实现大规模的生产。而另外一类则是生物催化法，多使用全细胞或者胞内酶还原奥卡西平以获得艾司利卡西平。CN102465159A公开了以奥卡西平为底物，以酿酒酵母发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，在pH 5.0～8.0的磷酸盐缓冲液中，进行生物转化反应制得艾利西平。CN107475211A公开了使用一株炭疽芽孢杆菌bacillus anthracis获得羰基还原酶，并通过构建两相反应体系，在油/水两相体系进行催化反应将奥卡西平转化为艾司利卡西平。生物催化法制备艾司利卡西平具有转化效率高、反应专一性强、成本低廉等优势，在未来必会有巨大的生产应用前景。但现有的酮基还原酶存在反应活性及专一性较差，对底物的耐受力差，反应效率低，所获得的产物存在较多的异构体成分难以去除等问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种酮基还原酶突变体及其制备方法、应用和艾司利卡西平的制备方法，为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种酮基还原酶突变体，所述酮基还原酶突变体为发生了氨基酸突变的酮基还原酶，所述酮基还原酶包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述氨基酸突变的类型包括D77S、P195Y、D207F、D77S/P195Y、P195Y/D207F、D77S/D207F或D77S/P195Y/D207F。
[0007]SEQ ID NO:1：
[0008]MAIPNIRLGSEAQVPVLAYGTGTTWIKQDGDSLDRKTIDGIKEAIELGYRHLDGAQYYGTEAELGQAI
RESGVPRSDFFITTKAVSHVDVEGSLRESCRKLQTDHVDLYLIHEPFSATDEQDLQQTWADMEICLDKGLARHIGVSNFLPTHLDSLVKTARVKPAVNQIELHPYLQRQKVIQYCRENGIVLQGFAPLTPFKVRAGPVDEICSKLAERHGVSESSILLRWVVDQGIIVITTSGQKTRLQQYLRELPNFVLSQEEVQEIAAAGKAKSVRQFFADGFGPDNFD。
[0009]在本专利技术中，所述酮基还原酶的编码序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0010]SEQ ID NO:2：
[0011]ATGGCGATACCAAATATTCGACTCGGTTCGGAAGCCCAAGTCCCTGTGCTCGCGTACGGCACTGGGACGACGTGGATCAAACAGGATGGGGACAGTCTAGACCGGAAGACGATTGATGGTATCAAAGAGGCGATAGAACTCGGCTACCGCCATCTTGATGGAGCACAATACTACGGCACTGAGGCAGAATTGGGGCAGGCCATCCGCGAGTCGGGTGTCCCTCGCTCCGATTTCTTCATAACAACAAAGGCCGTCTCACACGTCGACGTCGAGGGGTCGCTACGAGAGAGCTGTCGAAAGTTGCAAACGGATCATGTCGACCTATATCTCATACATGAACCATTCTCTGCAACGGACGAGCAAGATCTCCAGCAGACGTGGGCGGACATGGAGATCTGTCTTGACAAGGGGCTCGCTCGCCACATTGGCGTCTCCAACTTTCTCCCGACACACCTGGATTCTCTAGTCAAGACAGCCCGGGTGAAGCCGGCCGTCAACCAAATCGAGCTGCACCCGTACCTCCAGCGGCAGAAAGTCATCCAATACTGCAGGGAGAACGGCATCGTCTTGCAAGGGTTCGCCCCCCTCACTCCCTTCAAGGTCCGGGCCGGTCCGGTTGACGAGATCTGCTCCAAGCTGGCTGAACGACATGGCGTCAGTGAGTCCTCGATTCTCCTGCGATGGGTTGTGGACCAAGGAATCATTGTCATCACAACCAGCGGCCAGAAGACGCGCTTGCAACAATATTTGCGCGAGTTGCCTAACTTTGTGCTCTCCCAGGAGGAAGTGCAGGAGATAGCGGCAGCTGGCAAAGCCAAGAGCGTCAGGCAATTTTTTGCTGATGGGTTTGGACCCGACAACTTTGATTGA。
[0012]在本专利技术中，所述酮基还原酶来源于Microdochium trichocladiopsis。
[0013]在本专利技术中，通过在Microdochium trichocladiopsis(NCBI Reference Sequence:XP_046005050.1)来源的酮基还原酶的编码基因的氨基酸序列SEQ IDNO:1的基础上对第77位、195位或207位进行了一个或多个突变构建酮基还原酶突变体。
[0014]在本专利技术中，所述氨基酸突变的类型D77S为将SEQ ID NO:1的第77位天冬氨酸(Asp)突变为丝氨酸(Ser)获得的突变体，所述氨基酸突变的类型D77S包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
[0015]SEQ ID NO:3：
[0016]MAIPN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酮基还原酶突变体，其特征在于，所述酮基还原酶突变体为发生了氨基酸突变的酮基还原酶，所述酮基还原酶包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述氨基酸突变的类型包括D77S、P195Y、D207F、D77S/P195Y、P195Y/D207F、D77S/D207F或D77S/P195Y/D207F。2.根据权利要求1所述的酮基还原酶突变体，其特征在于，所述酮基还原酶的编码序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；优选地，所述酮基还原酶来源于Microdochium trichocladiopsis。3.根据权利要求1或2所述的酮基还原酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变的类型D77S包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型D77S的编码序列包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型P195Y包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型P195Y的编码序列包括SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型D207F包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型D207F的编码序列包括SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型D77S/P195Y包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型D77S/P195Y的编码序列包括SEQ IDNO.10所示的核苷酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型P195Y/D207F包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型P195Y/D207F的编码序列包括SEQ IDNO:12所示的核苷酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型D77S/D207F包括SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型D77S/D207F的编码序列包括SEQ IDNO:14所示的核苷酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型D77S/P195Y/D207F包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸突变的类型D77S/P195Y/D207F的编码序列包括SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列；优选地，获得D77S突变类型的正向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:17所示的序列，反向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:18所示的序列；优选地，获得P195Y突变类型的正向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:19所示的序列，反向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:20所示的序列；优选地，获得D207F突变类型的正向引的核苷酸物序列包括SEQ ID NO:21所示的序列，反向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:22所示的序列。4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1
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3中任一项所述的酮基还原酶突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝俊，徐飞，钟锦潮，张晨晨，陈剑，余长泉，
申请(专利权)人：厦门金达威集团股份有限公司南京桦冠生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：