一种炭疽菌CsOxdC基因及应用制造技术

本发明专利技术提供一种炭疽菌CsOxdC基因及应用，基因含有3个内含子，含有两个Cupin结构域。实验证实了该基因缺失可降低真菌对咯菌腈等吡咯类药剂抗性，说明CsOxdC基因可应用于调控真菌对吡咯类药剂的抗性，CsOxdC基因可以作为吡咯类药物靶标。咯类药物靶标。咯类药物靶标。

【技术实现步骤摘要】
一种炭疽菌CsOxdC基因及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种炭疽菌CsOxdC基因及应用。

技术介绍

[0002]草酸脱羧酶(oxalatedecarboxylase,Oxdc)是一种包含Mn
2+
的均一聚合酶，属Cupin蛋白超家族；它可以在没有辅因子的条件下催化草酸转化为甲酸和CO2，而草酸是丝状真菌分泌的最常见的有机酸，可以抑制对酸度或草酸更敏感的真菌的生长，从而影响真菌物种之间的竞争。另一方面，许多真菌物种通过分泌草酸来耐受其环境中高浓度的有毒金属。草酸脱羧酶是植物、微生物中草酸代谢降解的主要催化酶之一，该酶最早发现于白腐菌中，它主要来源于黑曲霉、核盘菌、金针菇和褐腐菌等真菌。目前，研究最彻底的是来自枯草芽孢杆菌的细菌OxdC，OxdC是酸性胁迫条件下枯草芽孢杆菌中表达最丰富的细菌细胞壁蛋白之一，该酶通过草酸脱羧消耗质子来保护细菌细胞免受低pH胁迫的影响。与枯草芽孢杆菌一样，低pH诱导了担子菌Flammulinavelutipes、子囊菌核盘菌Sclerotiniasclerotiorum和黑曲霉Aspergillusniger的Oxdc活性。从金针菇菌F.velutipes中克隆出oxdc基因转入甘蓝型油菜，转基因植株具有明显的延迟和抵御菌核病侵染的能力；转入番茄后转基因番茄中草酸减少而营养成分含量所增加；转入烟草后转基因烟草中草酸的含量减少且对由草酸和NLP诱发的植物程序性死亡表现出明显的抗性。但目前在真菌中未见有关草酸脱羧酶OxdC参与吡咯类药剂敏感性调控功能方面的报道。

技术实现思路

[0003]鉴于现有技术的不足，本专利技术提供了一种炭疽菌CsOxdC基因及应用。
[0004]本专利技术方案包括以下方面：
[0005]一种炭疽菌CsOxdC基因，所述基因含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
[0006]一种CsOxdC基因敲除突变体，包括以下制备步骤：第一轮PCR，在CsOxdC基因编码阅读框架前后，设计引物对CsOxdC
‑
UF/CsOxdC
‑
UR和CsOxdC
‑
DF/CsOxdC
‑
DR，利用PCR扩增获得CsOxdC基因上臂序列和C端后的下臂序列，CsOxdC
‑
UR和CsOxdC
‑
DF分别含有氯嘧磺隆抗性基因接头序列，设计引物对S1F/S2R扩增得到氯嘧磺隆抗性基因ILV1；
[0007]第二轮PCR，将第一轮PCR扩增得到的产物利用引物CsOxdC
‑
UF/CsOxdC
‑
UR进行融合；
[0008]第三轮PCR，将第二轮PCR融合的产物利用引物CsOxdC
‑
UF/CsOxdC
‑
DR进行富集；将富集的片段导入橡胶树炭疽菌原生质体中，通过含氯嘧磺隆的培养基进行筛选，然后PCR验证，即得；
[0009]所述CsOxdC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0010]引物CsOxdC
‑
UF的序列为：5
’‑
CCAACATGCCGTCGAAACC
‑3’
[0011]引物CsOxdC
‑
UR的序列为：
[0012]5’‑
AGATGTGGGGCACTGTGGCGTTGGCACGATGGGCGTGAAGTAGGAAGG
‑3’
[0013]引物CsOxdC
‑
DF的序列为：
[0014]5’‑
TATTGCACGGGAATTGCATGCTCTCACGGGAGCACTGCCACAATGGAA
‑3’
[0015]引物CsOxdC
‑
DR的序列为：5
’‑
CTGCTTCTAGTTCGAGAAGCG
‑3’
[0016]引物S1F的序列为：5
’‑
GTGCCAACGCCACAGTGCCCCACA
‑3’
[0017]引物S2R的序列为：5
’‑
GTGAGAGCATGCAATTCCCGTGCAATA
‑3’
。
[0018]本专利技术还涉及所述的炭疽菌CsOxdC、所述的CsOxdC基因敲除突变体中在调控真菌对吡咯类药剂敏感性方面的应用。
[0019]进一步的，本专利技术涉及所述的炭疽菌CsOxdC在作为吡咯类药剂作用靶点方面的应用。
[0020]进一步的，本专利技术涉及所述的CsOxdC基因敲除突变体在降低真菌对吡咯类药剂敏感性方面的应用。
[0021]进一步的，所述吡咯类药剂为咯菌腈。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0023]本专利技术克隆了CsOxdC基因，构建了CsOxdC基因敲除突变体，经过功能性实验证实了该基因参与调控真菌对咯菌腈等吡咯类药剂的敏感性。因此，CsOxdC基因可以作为药物靶标，能抑制CsOxdC基因表达的药物，都可作为抑制真菌生长的杀菌剂。
附图说明
[0024]图1：CsOxdC基因敲除示意图。
[0025]图2：基因缺失突变体
△
CsOxdC的PCR验证结果图。
[0026]图3：野生型HN08菌株、突变体
△
CsOxdC菌株在不同咯菌腈浓度的CM培养基的菌落生长形态(5d)。
具体实施方式
[0027]为了便于技术人员理解本专利技术
技术实现思路
，下面结合具体实施例和附图对本专利技术做进一步的详细说明。
[0028]实施例1橡胶树炭疽菌CsOxdC基因的克隆
[0029]根据前期酵母双杂技术获得的序列片段，利用BLAST技术，在NCBI中搜索获得的暹罗炭疽菌(C.siamense)草酸脱羧酶CsOxdC的基因全长序列，设计引物对
[0030]CsOxdC
‑
F(5
’‑
ATGCATCTCCCGCTCCTCT
‑3’
)/CsOxdC
‑
R(5
’‑
AAGTTCGTCGGTCTGAGTGC
‑3’
)以橡胶树炭疽菌C.siamenseHN08的cDNA和DNA为模板，分别扩增获得目的条带。序列分析显示：所得到的序列包含完整的编码开放阅读框。DNA序列大小为1576bp，cDNA序列大小为1395bp，该基因含有3个内含子，含有两个Cupin结构域，说明CsOxdC为Cupin蛋白超家族中的基因。将该基因命名为CsOxdC。
[0031]实施例2CsOxdC基因敲除突变体的获得
[0032]基于同源重组技术结合炭疽菌的生物学特性，在炭疽菌基因组数据库获得上下游片段序列。
[0033]第一轮PCR，在CsOxdC基因编码阅读框架前后，设计引物对CsOxdC
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种炭疽菌CsOxdC基因，其特征在于，所述基因含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。2.一种CsOxdC基因敲除突变体，其特征在于，包括以下制备步骤：第一轮PCR，在CsOxdC基因编码阅读框架前后，设计引物对CsOxdC
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UF/CsOxdC
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UR和CsOxdC
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DF/CsOxdC
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DR，利用PCR扩增获得CsOxdC基因上臂序列和C端后的下臂序列，CsOxdC
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UR和CsOxdC
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DF分别含有氯嘧磺隆抗性基因接头序列，设计引物对S1F/S2R扩增得到氯嘧磺隆抗性基因ILV1；第二轮PCR，将第一轮PCR扩增得到的产物利用引物CsOxdC
‑
UF/CsOxdC
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DR进行融合；第三轮PCR，将第二轮PCR融合的产物利用引物CsOxdC
‑
UF/CsOxdC
‑
DR进行富集；将富集的片段导入橡胶树炭疽菌原生质体中，通过含氯嘧磺隆的培养基进行筛选，然后PCR验证，即得；所述CsOxdC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；引物CsOxdC
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UF的序列为：5
’‑
CCAACATGCCGTCGAAACC
‑3’
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【专利技术属性】
技术研发人员：林春花，鲁婧文，关小灵，张宇，缪卫国，刘文波，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：