一种在人体全血中检测脐带源间充质干细胞含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种在人体全血中检测脐带源间充质干细胞含量的方法。所述方法包括如下步骤：向女性体内输注来源于男孩脐带的间充质干细胞或间充质干细胞制剂，然后通过qPCR定量检测输注间充质干细胞或间充质干细胞制剂后的女性全血基因组DNA中SRY基因的拷贝数获得人体全血中的间充质干细胞含量。经验证表明，本发明专利技术提供的脐带源间充质干细胞含量检测方法可靠、准确、并有稳定性指示能力，可用于间充质干细胞在人体血液中药代动力学研究。质干细胞在人体血液中药代动力学研究。

【技术实现步骤摘要】
一种在人体全血中检测脐带源间充质干细胞含量的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种在人体全血中检测脐带源间充质干细胞含量的方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类来源于发育早期中胚层和外胚层的多功能干细胞，具有成体干细胞的自我更新和多向分化潜能，可以分化成多种结缔组织细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，在体内分布较广泛。MSCs在一定条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，因此在不同的组织中均存在MSCs，如脂肪、胎盘、肌肉、血液、牙髓以及脐带等。MSCs可以治疗自身免疫性疾病、炎症和退行性疾病，且在各种动物模型治疗中应用广泛。其中，脐带源间充质干细胞具有较高的增殖和自我更新能力，其免疫原性低，且不存在道德伦理问题，取材方便，是一种在兽医和人类医学应用中有广阔前景的间充质干细胞来源。
[0003]研究表明，MSCs具有多向分化能力、免疫调节作用、归巢能力和旁分泌作用，有助于损伤组织修复。MSCs还能够抑制免疫系统过度激活，抑制炎症反应，同时提高机体免疫力，增强抗病毒的能力。MSCs能够不受组织相容性分子的约束，从而使其免疫原性非常低，导致其对自身和异体的免疫细胞都可以实现免疫调节作用。MSCs能够通过分泌定量的细胞因子等方式激活体内的T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等的分裂增殖、分泌等从而发挥调理作用。研究发现，经脂多糖活化的MSCs能够表达趋化因子，并分泌大量炎症因子，如白细胞介素8、巨噬细胞迁移抑制因子募集中性粒细胞。MSCs可分泌肝细胞生长因子、肿瘤生长因子
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β、白细胞介素6、白细胞介素10等30种可溶性因子调节抑制T细胞活化和增殖，抑制炎症反应。
[0004]MSCs的药代动力学(Pharmacokinetics，PK)研究不仅可以预测血药水平，制定最佳给药方案、计量和给药频度，指导合理用药；还可以表征生物效能，药物相互作用及浓度，因此具有重要意义。然而目前MSCs在体内分布和代谢研究常采用细胞体外标记后再移植入体内的方法，主要的标记方法有荧光素酶、近外红染料、荧光蛋白和磁性离子等，相应地检测方法有生物发光成像、磁共振成像、单光子发射CT(computer tomography)扫描等，可以动态观察干细胞在体内的分布情况。但以上研究手段经常用于动物中，对人体有一定放射性伤害，同时，某些标记手段会对MSCs的活性有影响，比如，同位素标记有可能损伤MSCs活力和分化能力；而新型的纳米碳量子点追踪MSCs体内动态的同时，可以促进骨髓MSCs向成骨细胞分化，人为地提高了MSCs的清除速率。鉴于以上现状，目前MSCs的药代动力学研究还主要存在于非临床及动物实验阶段，在临床治疗阶段的药代动力学的研究鲜有报道，因此亟需开发一种既不损伤MSCs活性，并且不会给人体带来其他损伤的间充质干细胞含量检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供一种既不损伤MSCs活性，并且不会给人体带来其他损伤的间充质干细胞含量检测方法及其在MSCs药代动力学研究中的应用。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种人体全血中间充质干细胞含量的检测方法。
[0007]本专利技术提供的人体全血中间充质干细胞含量的检测方法包括如下步骤：向女性体内输注来源于男孩脐带的间充质干细胞或间充质干细胞制剂，然后通过qPCR(荧光定量PCR)定量检测输注间充质干细胞或间充质干细胞制剂后的女性全血基因组DNA中SRY基因的拷贝数获得人体全血中的间充质干细胞含量。
[0008]上述方法中，所述SRY基因位于人Y染色体基因组上，其核苷酸序列如序列1第415
‑
1301位所示。
[0009]上述方法中，所述qPCR定量检测输注间充质干细胞或间充质干细胞制剂后的女性全血基因组DNA中SRY基因的拷贝数的方法包括如下步骤：
[0010](d1)从输注间充质干细胞或间充质干细胞制剂后的女性全血样本中提取基因组DNA；
[0011](d2)以所述基因组DNA为模板，采用用于检测SRY基因的引物对进行qPCR，获得Cq值；
[0012](d3)将所述Cq值代入标准曲线方程，从而计算所述基因组DNA中SRY基因的拷贝数，该拷贝数即为全血样本中的间充质干细胞个数；
[0013]所述标准曲线方程按照如下获得：用系列已知拷贝数的含有所述SRY基因的质粒标准品溶液替代所述基因组DNA进行步骤(d1)
‑
(d2)，测得各拷贝数的质粒标准品溶液对应的Cq值，从而获得质粒标准品溶液拷贝数与Cq值之间的标准曲线方程。
[0014]进一步的，所述基因组DNA为从输注间充质干细胞或间充质干细胞制剂3小时后的女性全血样本中提取的基因组DNA。
[0015]所述基因组DNA的提取可采用Qiagen公司全血DNA提取试剂盒QIAamp DNA Blood Mini Kit进行，具体可包括如下步骤：
[0016]1)吸取蛋白酶加入至离心管底部；
[0017]2)完成步骤1)后，向离心管中加入全血样本；
[0018]3)完成步骤2)后，向离心管中加入Buffer AL，漩涡混匀；
[0019]4)完成步骤3)后，转移离心管于恒温金属浴56℃保温10min；
[0020]5)完成步骤4)后，短暂离心，移除离心管盖的液珠；
[0021]6)完成步骤5)后，向离心管中加入96
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100％乙醇溶液，漩涡混匀后短暂离心，移除离心管盖的液体；
[0022]7)完成步骤6)后，将离心管中的混合物转移至提取柱中，离心(8000rpm离心1min)，弃掉有滤液的收集管，换新的收集管；
[0023]8)完成步骤7)后，打开提取柱管盖，加入Buffer AW1，开盖静置5min，使洗涤液在重力的作用下缓慢渗透过吸附膜，以彻底洗脱盐分等污染物，离心(8000rpm离心1min)，弃掉有滤液的收集管，换新的收集管；
[0024]9)完成步骤8)后，打开提取柱管盖，加入Buffer AW2，离心(14000rpm离心3min)；
[0025]10)完成步骤9)后，将提取柱放入新的收集管中，高速离心；
[0026]11)完成步骤10)后，弃去含有滤液的收集管，将提取柱放入干净的离心管中，打开提取柱，加入Buffer AE，室温放置数分钟后，离心(8000rpm离心1min)，收集滤液于离心管中，即为从全血样本中提取得到的基因组DNA。
[0027]再进一步的，所述用于检测SRY基因的引物对由序列2所示的单链DNA和序列3所示的单链DNA组成。
[0028]含有所述SRY基因的质粒标准品为将所述SRY基因插入至pUC19质粒载体后得到的质粒，该质粒的核苷酸序列具体如序列1所示。
[0029]更进一步的，所述系列已知拷贝数的质粒标准品溶液为含有2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人体全血中间充质干细胞含量的检测方法，包括如下步骤：向女性体内输注来源于男孩脐带的间充质干细胞或间充质干细胞制剂，然后通过qPCR定量检测输注间充质干细胞或间充质干细胞制剂后的女性全血基因组DNA中SRY基因的拷贝数获得人体全血中的间充质干细胞含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SRY基因的核苷酸序列如序列1第415
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1301位所示。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述qPCR定量检测输注间充质干细胞或间充质干细胞制剂后的女性全血基因组DNA中SRY基因的拷贝数的方法包括如下步骤：(d1)从输注间充质干细胞或间充质干细胞制剂后的女性全血样本中提取基因组DNA；(d2)以所述基因组DNA为模板，采用用于检测SRY基因的引物对进行qPCR，获得Cq值；(d3)将所述Cq值代入标准曲线方程，从而计算所述基因组DNA中SRY基因的拷贝数；所述标准曲线方程按照如下获得：用系列已知拷贝数的含有所述SRY基因的质粒标准品溶液替代所述基因组DNA进行步骤(d1)
‑
(d2)，测得各拷贝数的质粒标准品溶液对应的Cq值，从而获得质粒标准品溶液拷贝数与Cq值之间的标准曲线方程。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的方法，其特征在于：所述用于检测SRY基因的引物对由序列2所示的单链DNA和序列3所示的单链DNA组成。5.根据权利要求1
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，潘锦华，齐奇，王磊，张金龙，侯瑞珍，杨文玲，
申请(专利权)人：武汉光谷中源药业有限公司，
类型：发明
国别省市：