一种基于EFIRM技术的EGFR突变检测探针试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于EFIRM技术的EGFR突变检测探针试剂盒及其检测方法，所述试剂盒，包括用于检测L858R突变的探针对、检测19Del突变的探针对、检测T790M突变的探针对。本发明专利技术通过在捕获序列左侧添加长链核苷酸，增加附着，避免微量有毒试剂的使用，增加了安全性，在检测序列增加修饰，提高检测灵敏度，并减少了预处理环节。采用本发明专利技术的探针试剂盒，检测结果的真阳匹配率更高，检测灵敏度也得到了明显提高。高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于EFIRM技术的EGFR突变检测探针试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种基于EFIRM技术的EGFR突变检测探针试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是表皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB
‑
1),HER2/c
‑
neu(ErbB
‑
2),Her3(ErbB
‑
3)和Her4(ErbB
‑
4)，EGFR属于酪氨酸激酶型受体。在包括肺癌在内的各类肿瘤中，频繁发现EGFR基因的过度表达，而且还与预后有关，因此EGFR作为分子靶标倍受瞩目。
[0003]研究表明，EGFR突变基因与酪氨酸激酶抑制类药物(TKI)使用有疗效关联，这些药物包括Iressa(易瑞沙)和Tarceva(特罗凯)，EGFR基因突变影响着TKI的临床疗效。EGFR突变主要包括4种类型：外显子19缺失突变、外显子2l点突变、外显子18点突变和外显子20插入突变。目前发现EGFR基因突变90％以上的突变位于外显子19、21，最常见的EGFR突变为外显子19 LREA缺失和外显子21 L858R突变，二者均会导致酪氨酸激酶结构域活化，且均为TKI的敏感性突变，外显子20的T790M突变与EGFR
‑
TKI获得性耐药有关。r/>[0004]EFIRM技术是最近几年来发展起来的基于电化学检测方法的新型检测技术,可用检测突变基因、蛋白、外泌体等，基于三项主要专利技术,即超高高活性分子探针的固定、瞬间目标分子抓取和分子信号的特异性放大。具备准确、成本较低、重现性好、对环境要求低、可操作性强等诸多优势。EFIRM技术与PCR技术相结合，是一种新型基因突变检测技术。将EFIRM技术用于EGFR基因突变检测已有报道，但已有的检测探针固着效率低，捕获和检测的灵敏度都有待提高。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种灵敏度更高的基于EFIRM技术的EGFR突变检测探针试剂盒及其检测方法。
[0006]本专利技术为了实现其目的，采用的技术方案是：
[0007]一种基于EFIRM技术的EGFR突变检测探针试剂盒，包括用于检测L858R突变的探针对，所述探针对包含捕获探针CP和检测探针DP；
[0008]探针对的核苷酸序列为：
[0009]L858R CP：
[0010]5’‑
AAAAAAAAAAGAAATAAACAAATAAAACAATAACAAATAAAAAAAAACAAATAAACAATAAAAAAAAACAGTTTGGCCCGCCCAAAATC
‑3’
，
[0011]L858R DP：
[0012]5’‑
TGTGATCTTGACATGCTGCGGTGTT
‑3’
；
[0013]所述L858R DP的3
’
端有Biotin修饰。
[0014]所述用于检测L858R突变的探针对的靶序列为：
[0015]5’‑
CTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTG
‑3’
。
[0016]上述的探针试剂盒，还包括用于检测19Del突变的探针对，
[0017]探针对的核苷酸序列为：
[0018]19DEL CP：
[0019]5’‑
AAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAACTTCGGAGATGTTGCTTCCTTG
‑3’
,
[0020]19DEL DP：
[0021]5’‑
ATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCA
‑3’
，
[0022]所述19DEL DP的3
’
端有Biotin修饰。
[0023]所述用于检测19Del突变的探针对的靶序列为：
[0024]5’‑
AGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAA
‑3’
。
[0025]上述的探针试剂盒，还包括用于检测T790M突变的探针对，
[0026]探针对的核苷酸序列为：
[0027]T790M CP：
[0028]5’‑
AAAAAAAAAAGAAATAAACAAATAAAACAATAACAAATAAAAAAAAACAAATAAACAATAAAAAAAAACAAGGGCATGAGCGGCATGATGA
‑3’
,
[0029]T790M DP：
[0030]5’‑
GCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATG
‑3’
，
[0031]所述T790M DP的3
’
端有Biotin修饰。
[0032]所述用于检测T790M突变的探针对的靶序列为：
[0033]5’‑
GCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCC
‑3’
。
[0034]一种非诊断目的的基于EFIRM技术的EGFR突变检测方法，采用上述任一项所述的探针试剂盒检测，包括以下步骤：
[0035]将捕获溶液加入到检测孔板中，电场处理3
‑
10个循环，每个循环电场处理的程序为：电压200
‑
500mV，1
‑
5s；电压800
‑
1500mV，1
‑
5s；所述捕获溶液含有以下成分：导电聚合物材料的体积百分数为0.1％～5％，盐离子化合物的浓度为0.01mol/L～2mol/L，捕获探针的浓度为0.5
‑
1.5μmol/L；
[0036]电场处理完毕后采用清洗剂清洗，然后加入待测样本与杂交buffer的混合溶液，电场处理3
‑
10个循环，每个循环电场处理的程序为：电压200
‑
500mV，1
‑
5s；电压300
‑
800mV，1
‑
5s；
[0037]所述清洗剂包括含有质量浓度为0.04％
‑
0.06％SDS的0.1
×
SSC
‑2×
SSC混合液和含有体积百分数为0.05％
‑
0.15％Tween20的PBS溶液；
[0038]检测孔板清洗，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于EFIRM技术的EGFR突变检测探针试剂盒，其特征在于，包括用于检测L858R突变的探针对，所述探针对包含捕获探针CP和检测探针DP；探针对的核苷酸序列为：L858R CP：5
’‑
AAAAAAAAAAGAAATAAACAAATAAAACAATAACAAATAAAAAAAAACAAATAAACAATAAAAAAAAACAGTTTGGCCCGCCCAAAATC
‑3’
，L858R DP：5
’‑
TGTGATCTTGACATGCTGCGGTGTT
‑3’
；所述L858R DP的3
’
端有Biotin修饰。2.根据权利要求1所述的基于EFIRM技术的EGFR突变检测探针试剂盒，其特征在于：所述用于检测L858R突变的探针对的靶序列为：5
’‑
CTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTG
‑3’
。3.根据权利要求1所述的基于EFIRM技术的EGFR突变检测探针试剂盒，其特征在于：还包括用于检测19Del突变的探针对，探针对的核苷酸序列为：19DEL CP：5
’‑
AAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAACTTCGGAGATGTTGCTTCCTTG
‑3’
,19DEL DP：5
’‑
ATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCA
‑3’
，所述19DEL DP的3
’
端有Biotin修饰。4.根据权利要求3所述的基于EFIRM技术的EGFR突变检测探针试剂盒，其特征在于：所述用于检测19Del突变的探针对的靶序列为：5
’‑
AGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAA
‑3’
。5.根据权利要求1所述的基于EFIRM技术的EGFR突变检测探针试剂盒，其特征在于：还包括用于检测T790M突变的探针对，探针对的核苷酸序列为：T790M CP：5
’‑
AAAAAAAAAAGAAATAAACAAATAAAACAATAACAAATAAAAAAAAACAAATAAACAATAAAAAAAAACAAGGGCATGAGCGGCATGATGA
‑3’
,T790M DP：5
’‑
GCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATG
‑3’
，所述T790M DP的3
’
端有Biotin修饰。6.根据权利要求5所述的基于EFIRM技术的EGFR突变检测探针试剂盒，其特征在于：所述用于检测T790M突变的探针对的靶序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晋峰，张建芝，张晨光，
申请(专利权)人：北京肿瘤医院北京大学肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：