一种酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用，一种酯酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；实验表明，本发明专利技术的酯酶突变体基因表达的蛋白能够正确折叠，在大肠杆菌系统能够大量纯化。同时本发明专利技术的突变蛋白具有野生型酯酶降解PET的功能，酯酶突变体基因表达的蛋白的热稳定性及催化效率与野生型酯酶相比显著增加。本发明专利技术的酯酶突变体基因表达的蛋白在pH为6

【技术实现步骤摘要】
一种酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用


[0001]本专利技术属于蛋白的基因工程领域，具体的涉及一种酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用。
技术背景
[0002]塑料在现代社会中发挥着重要作用，广泛应用于包装、建筑、纺织、运输、电子设备以及工业机械等方面，极大地改变了人类的生活方式。众多种类塑料之中，聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate，PET)因其重量轻、绝缘性好、强度和透明度高、热性能高、耐化学腐蚀等优良性能，成为应用最广泛的聚酯塑料之一。随着PET产品的大量使用和消费，越来越多的塑料废品在环境中积累，已经对全球的生态环境造成了严重的破坏，给人类健康也带来了严重威胁。
[0003]生物法是近年来兴起的一种新型PET降解回收技术，通过生物实体(如微生物，即细菌、真菌和海洋微藻)或酶的作用分解这类有机物质。生物法的优点包括温和的工艺条件、相对较低的能量输入、不需要危险化学试剂和昂贵的机械，使其成为一个非常有前景的选择。近期，日本科学家报道了一种细菌(大阪伊德氏杆菌：Ideonella sakaiensis 201
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F6)可以产生水解PET的酯酶。与其它PET水解酶相比，该酯酶可以在常温(30℃)发挥降解功能；且只专一性降解PET，而不降解其它类型的聚酯塑料；酯酶能够降解商业化的高结晶度塑料瓶。但由于酯酶的催化效率和热稳定性等方面存在明显不足，导致目前无法实现工业应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种针对于PET水解的酯酶突变体基因。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供一种上述酯酶突变体基因表达的蛋白。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供一种含上述酯酶突变体基因的质粒。
[0007]本专利技术的第四个目的是提供一种含上述质粒的重组菌株。
[0008]本专利技术的第五个目的是提供上述蛋白在水解PET中的应用。
[0009]本专利技术的技术方案概述如下：
[0010]一种酯酶突变体基因，所述基因简称为A基因，所述酯酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]含上述基因的质粒，用下述方法构建：以SEQ ID NO.2所示序列为模板，以F1为正向引物，以R1为反向引物，经过PCR，得到含有酯酶突变体基因的序列，经酶切及T4 DNA连接酶连接，将酯酶突变体基因构建到pET
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21b(+)载体，得到含上述基因的质粒pET
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21b
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A；F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0013]含有上述质粒的重组菌株，用下述方法构建：将质粒pET
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21b
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A转化到大肠杆菌
BL21(DE3)菌株中，得到重组菌株。
[0014]上述蛋白在水解PET中的应用。
[0015]本专利技术的优点：
[0016]实验表明，本专利技术的酯酶突变体基因表达的蛋白能够正确折叠，在大肠杆菌系统能够大量纯化。同时本专利技术的突变蛋白具有野生型酯酶降解PET的功能，酯酶突变体基因表达的蛋白的热稳定性及催化效率与野生型酯酶相比显著增加。本专利技术的酯酶突变体基因表达的蛋白在pH为6
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11范围内均具有降解PET的活性。本专利技术的酯酶突变体基因表达的蛋白在30℃
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70℃具有活性且稳定。具体地，在pH 9.0，温度为50℃时对PET的降解能力与野生型酯酶相比提高了58倍。
附图说明
[0017]图1为野生型酯酶蛋白凝胶色谱层析检测图。
[0018]图2为酯酶突变体基因表达的蛋白凝胶色谱层析检测图。
[0019]图3为酯酶突变体基因表达的蛋白SDS
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PAGE凝胶检测图。
[0020]图4为酯酶突变体基因表达的蛋白在50℃下对PET的降解活性图。
具体实施方式
[0021]表达载体pET
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21b(+)为市售，大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)为市售。
[0022]实验材料：
[0023](1)LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加入双蒸水定容至1L，121℃、0.1MPa高压灭菌20分钟。LB固体培养基:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，加入双蒸水定容至1L，121℃、0.1MPa高压灭菌20分钟。
[0024](2)氨苄青霉素(100mg/mL)：2g氨苄青霉素固体粉末，加入到20mL灭菌的去离子水中，轻摇使其充分溶解，使用0.22μm滤器过滤除菌；
[0025](3)异丙基硫代
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β
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D
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半乳糖苷(IPTG)：在无菌环境下，10g IPTG粉末溶解于42mL灭菌的双蒸水，充分混匀。
[0026](4)SDS
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PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)
[0027]10％ APS(过硫酸铵)溶液：1g APS固体粉末，加入灭菌水至10mL使其充分溶解。
[0028]10％ SDS(十二烷基硫酸钠)溶液：1g SDS固体粉末，加入灭菌水至10mL使其充分溶解。
[0029]30％丙烯酰胺溶液(100mL)：将30g丙烯酰胺与0.8g的甲叉双丙烯酰胺加双蒸水定容至100mL。
[0030]1.5M Tris
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HCl pH＝8.8缓冲液(1L)：称取181.71g Tris溶解在800mL纯水中，调pH至8.8，定容至1L。
[0031]0.5M Tris
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HCl pH＝6.8缓冲液(500mL)：称取60.57g Tris溶解在400mL纯水中，调pH至6.8，定容至500mL。
[0032]表1 12％ SDS
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PAGE分离胶
[0033][0034]表2SDS
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PAGE浓缩胶
[0035][0036](5)5
×
Tris
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甘氨酸电泳缓冲液(5L)：75.5g Tris，470g甘氨酸，25g SDS，加纯水溶解，定容至5L。
[0037](6)pH 2.5磷酸盐缓冲液：配置0.02M NaH2PO4，用H3PO4调pH到2.5，最终定容至1L。
[0038](7)终止液：75mL pH 2.5磷酸盐缓冲液，25mL甲醇。
[0039]下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，以下所述，仅是本专利技术的部分较佳实施例，并非对本专利技术做其他形式的限制。凡是未脱离本专利技术的方案内容，依据本专利技术的技术实质对实施例所做的任何修改或等同变化，均在本专利技术的保护范围内。
[0040]实施例1：pET
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酯酶突变体基因，所述基因简称为A基因，所述酯酶突变体基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。2.权利要求1的酯酶突变体基因表达的蛋白，其特征是所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。3.含权利要求1所述基因的质粒，其特征是用下述方法构建：以SEQ ID NO.2所示序列为模板，以F1为正向引物，以R1为反向引物，经过PCR，得到含有酯酶突变体基因的序列，经酶切及T4 DNA连接酶连接，将酯酶突变体基因构建到pET
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21b(+...

【专利技术属性】
技术研发人员：王泽方，张晗笑，肖云杰，王珅，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：