一种重组人源制造技术

本发明专利技术提供了一种重组人源

【技术实现步骤摘要】
一种重组人源
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型胶原蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种重组人源
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型胶原蛋白及其制备方法和应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]胶原蛋白是动物机体中重要的细胞外基质组成成分，在细胞迁移、细胞代谢、细胞信号通路应答、血小板凝聚、细胞、组织、器官的正常生理功能的维护、调节及损伤修复等方面有重要作用。胶原蛋白作为重要的天然生物蛋白具有良好的生物相容性、生物活性和可降解性，可广泛应用于化工、医药、食品、化妆品等众多领域。
[0003]目前胶原蛋白的主要获取方式为利用酸、碱、酶解法处理动物组织获得的胶原提取物，动物组织中提取胶原蛋白的技术已较为成熟，但此方法在生产过程中提取的胶原肽性质不均、批间差异大、有病毒感染的安全隐患，且动物源胶原氨基酸序列与人源蛋白的序列差异较大，易导致免疫原性以及过敏反应。另外，胶原蛋白的获取是通过基因工程技术表达，目前主要利用包括大肠杆菌、毕赤酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞以及植物等系统进行表达生产，以上表达系统中，也存在一些不足，如大肠杆菌系统表达产物后续纯化难度大；哺乳动物细胞表达成本高、产量低；昆虫细胞表达系统同样成本较大高、成量低，并且翻译后与人细胞有较大差异；植物表达周期较长，不适合工厂化生产；毕赤酵母表达系统虽然拥有可高密度发酵生产、极低的培养成本、短周期、高表达等规模化工业生产的优点，但是也无法确定可以适用于所有类型的胶原蛋白表达。
[0004]目前，研究较多的重组人胶原蛋白多以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型为主，对<br/>Ⅵ
型胶原蛋白的研究甚少，人
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型胶原是存在于所有细胞外基质（ECM）中的一类胶原，能够结合ECM的不同物质，从而将细胞桥接到周围的结缔组织，并组织骨骼肌，肌腱，骨骼和软骨的三维组织结构。通过与基底层中的Ⅳ型胶原和其它珍珠白蛋白结合，
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型胶原可以在肌肉细胞和ECM之间建立紧密的联系。
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型胶原作为细胞外基质的主要成分，能够在创面修复中促进纤维细胞的粘附，并能够增强软骨细胞的再生，在创面愈合中发挥重要的作用。
[0005]人
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型胶原天然状态下的高级结构为哑铃装，中间为不连续的三螺旋区，N端和C端为长度和数量不一的球状结构，人
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型胶原有6条不同的单链，大小范围130KD到300 KD以上。目前市面上未有关于重组的
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型胶原商品，也未有通过毕赤酵母表达系统获取该类胶原蛋白的报道，并且该类胶原重组表达有技术难度，天然序列在重组表达过程中会很容易被降解。
[0006]所以，本
亟需一种具备良好稳定性、具有生物学活性并能够重组表达的
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型胶原蛋白。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于，克服现有技术中存在的一些技术问题，通过对人天然
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型胶原序列进行选取以及设计，利用毕赤酵母菌株构建表达系统，成功表达出具有生物学活性
的
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型胶原。
[0008]为此，本专利技术提供一种重组人源
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型胶原蛋白、编码该胶原蛋白的多核苷酸、含有编码该胶原蛋白的多核苷酸的重组载体、工程菌、制备该胶原蛋白的方法、包含该胶原蛋白的组合物、该胶原蛋白的应用。本专利技术的
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型胶原蛋白，是从人
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型胶原蛋白的第257
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590位氨基酸序列中优化筛选后选取的序列，并在此基础上，选取第183
‑
307位氨基酸进一步重组后的序列。本专利技术中已经证实该胶原蛋白不但能够实现人
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型胶原胶原蛋白于毕赤酵母的高效分泌表达，而且还具有更为优异的细胞粘附活性，并且可工业化应用。
[0009]本专利技术提供了一种重组人源
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型胶原蛋白，所述胶原蛋白具有生物学活性。
[0010]所述重组人源
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型胶原蛋白，包括A所示的氨基酸序列或以A为基础单元串联重复得到的氨基酸序列，所述A为一下任一：（1）包括SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；（2）在SEQIDNO.2所示的氨基酸序列基础上进行一定程度上的氨基酸替换、插入、取代、添加、缺失等修改后的氨基酸序列；（3）与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有大于80%同一性的氨基酸序列；其中每个A相同或不同并且以A为基础单元串联重复，每个相同或不同的A之间直接通过肽键相连接。
[0011]进一步的，所述A为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。
[0012]进一步的，所述基础单元重复次数为4次，所述重组人源
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型胶原蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。
[0013]本专利技术还提供编码上述重组人源
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型胶原蛋白的多核苷酸，优选的，所述多核苷酸包括编码A的核苷酸序列或以编码A的核苷酸序列为基础单元串联重复得到的核苷酸序列，进一步的，所述多核苷酸包括SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示的核苷酸序列、或其简并序列。
[0014]本专利技术还提供了包含编码上述胶原蛋白的多核苷酸的重组表达载体。
[0015]本专利技术还提供由上述重组表达载体构建的工程菌，所述工程菌的宿主细胞优选为毕赤酵母。所述工程菌菌种保藏编号分别是：CGMCCNo.26125、CGMCCNo.26126。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2022年11月11日。分类命名：巴斯德毕赤酵母（Komagataellaphaffii，也有写为Pichiapastoris）。
[0016]本专利技术还提供上述胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：对本专利技术构建的工程菌分批补料培养，将工程菌接入含种子培养基YPG中，培养得到种子液；将种子液接种至发酵培养基；发酵过程中添加补料培养基和诱导培养基，进行培养以及诱导表达，获得重组胶原蛋白发酵上清液。
[0017]发酵培养基：包括NH4H2PO4190.4g/L、KH2PO410.06g/L、CaSO4•
2H2O1.18g/L、K2SO418.2g/L、MgSO4•
7H2O14.9g/L、甘油40g/L；发酵培养基高温灭菌后待温度降至室温加入PTM1，用氨水调节pH至5.0。
[0018]补料培养基：50%W/V甘油，每升加12mLPTM1微量元素；诱导培养基：100%甲醇，每升加入12mLPTM1微量元素。
[0019]还包括所得到胶原蛋白的纯化：配制缓冲液A包括：20mMKH2PO4，pH4.0；
配制缓冲液B包括：20mM KH2PO4、1M NaCl，pH4.0。
[0020]以缓冲液A平衡阳离子交换介质至A215吸光值和电导率值都保持不变后，上样，检测紫外A215吸光值，当其上升时，开始接样。待上样结束后，关闭接样，再以缓冲液A平衡阳离子层析介质，当A215吸光值下降时，打开接样，直至紫外和电导降至最低且不再变化，停止接样。收集洗脱液，分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组人源
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型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源
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型胶原蛋白，包括A所示的氨基酸序列或以A为基础单元串联重复得到的氨基酸序列，所述A为如下任一：（1）包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；（2）在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基础上进行一定程度上的氨基酸替换、插入、取代、添加、缺失等修改后的氨基酸序列；（3）与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有大于80%同一性的氨基酸序列；其中每个A相同或不同并且以A为基础单元串联重复，每个相同或不同的A之间直接通过肽键相连接。2.根据权利要求1所述的重组人源
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型胶原蛋白，其特征在于，所述A为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的重组人源
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型胶原蛋白，其特征在于，所述基础单元重复次数为4次，所述重组人源
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型胶原蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1
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3任一项所述重组人源
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型胶原蛋白的，优选的，所述多核苷酸包括SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列、或其简并序列。5.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求4所述的多核苷酸。6.工程菌或细胞，其特征在于，所述工程菌或细胞包含权利要求4 所述的多核苷酸，或权利要求 5 所述的重组表达载体，优选地所述工程菌或细胞的宿主细胞优选为毕赤酵母。7.根据权利要求6所述的工程菌或细胞，所述工程菌或细胞的菌种保藏编号分别是：CGMCC No.26125、CGMCC No.26126。8.权利要求1
‑
3任一项所述重组人源
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型胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：将权利要求7所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小海，王丽萍，钱晨明，程鹏飞，王昊，豆荣昆，凡孝菊，
申请(专利权)人：江苏创健医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：