取代修饰的融合前RSVF蛋白及其用途制造技术

提供了在融合前构象中稳定的重组呼吸道合胞病毒(RSV)F胞外域三聚体的实施方案。还公开了编码所述RSV F胞外域三聚体的核酸和产生所述RSV F胞外域三聚体的方法。还公开了在对象中诱导免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述方法可以是通过向对象施用治疗有效量的重组RSV F胞外域三聚体来治疗或预防对象的RSV感染的方法。RSV感染的方法。

【技术实现步骤摘要】
取代修饰的融合前RSV F蛋白及其用途
[0001]本申请是2017年3月29日提交的题为“取代修饰的融合前RSV F蛋白及其用途”的中国专利申请201780021719.5的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2016年3月29日提交的美国临时申请第62/314,946号的优先权，其通过引用整体并入本说明书中。


[0004]本公开涉及多肽、多核苷酸、组合物及其用于引发和检测对呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫应答的方法。

技术介绍

[0005]呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺病毒属(Pneumovirus)中的包膜的非节段负链RNA病毒。这是儿童在他们生命的第一年毛细支气管炎和肺炎的最常见原因。RSV还引起反复感染，包括严重的下呼吸道疾病，这可能发生在任何年龄，特别是老年人或心脏、肺部或免疫系统受损的人。被动免疫目前用于预防由RSV感染引起的严重疾病，特别是在早产、具有支气管肺发育不良或先天性心脏病的婴儿中。
[0006]RSV的包膜蛋白RSV F最初表达为单一多肽前体，命名为F0。F0在内质网中发生三聚化，并在两个保守位点由细胞弗林蛋白酶样蛋白酶加工，产生F1、F2和Pep27多肽。Pep27多肽被切除并且不形成成熟F蛋白的一部分。F2多肽源自F0前体的N端部分，并通过两个二硫键与F1多肽连接。F1多肽通过跨膜结构域将成熟F蛋白锚定在膜中，所述跨膜结构域与约24个氨基酸的胞质尾连接。F2‑
F1异二聚体的三个原聚体组装形成成熟F蛋白，其采用亚稳“融合前”构象，所述构象被触发以经历融合病毒和靶细胞膜的构象变化。
[0007]已经鉴定出在融合前构象中稳定的RSV F蛋白在动物模型中产生比用在融合后构象中的RSV F蛋白观察到的更强的中和免疫应答。例如，先前显示包含“DS
‑
Cav1”取代(155C、290C、190F和207L)的重组RSV F胞外域在动物模型中引发中和免疫应答，其比针对基于融合后的RSV F免疫原所观察到的免疫应答大许多倍。尽管DS
‑
Cav1免疫原对于引发对RSV的免疫应答是有效的，但是可以引发甚至更大免疫应答的新RSV免疫原是感兴趣的，特别是用于预防或减少由RSV和母体免疫方案引起的最严重疾病。

技术实现思路

[0008]本文公开了免疫原的实施方案，包括使用基于结构设计的迭代循环开发的重组RSV F蛋白，其惊人地将RSV保护性滴度提高至比先前基于RSV F的免疫原(例如“DS
‑
Cav1”)提供的滴度高出约4倍。除了增强的免疫原性之外，本文公开的新型RSV F免疫原提供了优越的属性，例如不需要弗林蛋白酶切割和对热失活的抗原稳定性增加，其中几个实施方案比DS
‑
Cav1在60℃时更稳定10倍以上。
[0009]在一些实施方案中，提供了重组RSV F胞外域三聚体，其包含三个重组F2‑
F1胞外域
原聚体。所述原聚体各自包含RSV F位置104
‑
144的缺失和RSV F位置103和145之间的甘氨酸
‑
丝氨酸肽接头。另外，原聚体包含190F和207L空腔填充取代，以及任选地由155C和290C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键，以在融合前构象中稳定重组RSV F胞外域三聚体。此外，原聚体包含以下一种或多种：(a)由149C和458C取代引入的半胱氨酸之间的非天然的原聚体间二硫键，(b)由183GC和428C取代引入的半胱氨酸之间的非天然的原聚体间二硫键，(c)由369C和455C取代引入的半胱氨酸之间的非天然的原聚体间二硫键，和/或(d)由RSV F位置98
‑
100之一和RSV F位置360
‑
362之一的取代引入的半胱氨酸之间的非天然的原聚体间二硫键。重组RSV F胞外域三聚体在融合前构象中稳定，并因此包含可以特异性结合融合前特异性抗体例如D25、AM22和/或5C4的抗原位点
[0010]在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F2‑
F1胞外域原聚体包含S190F和V207L取代、由S155C和S290C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键、以及由A149C和Y458C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键，用于融合前构象的稳定化。
[0011]在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F2‑
F1胞外域原聚体包含S190F和V207L取代、由S155C和S290C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键、以及由N183GC和N428C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键，用于融合前构象的稳定化。
[0012]在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F2‑
F1胞外域原聚体包含S190F和V207L取代、由S155C和S290C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键、由N183GC和N428C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键、以及由A149C和Y458C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键，用于融合前构象的稳定化。
[0013]在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F2‑
F1胞外域原聚体包含S190F和V207L取代、由S155C和S290C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键、以及由T369C和T455C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键，用于融合前构象的稳定化。
[0014]在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F2‑
F1胞外域原聚体包含S190F和V207L取代、由S155C和S290C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键、以及由L98C和Q361C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键，用于融合前构象的稳定化。
[0015]在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F2‑
F1胞外域原聚体包含S190F和V207L取代、由S155C和S290C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键、以及由L99C和Q361C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键，用于融合前构象的稳定化。
[0016]在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F2‑
F1胞外域原聚体包含S190F和V207L取代、由S155C和S290C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键、以及由L100C和Q362C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键，用于融合前构象的稳定化。
[0017]在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F2‑
F1胞外域原聚体包含S190F和V207L取代、以及由A149C和Y458C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键，用于融合前构象的稳定化。
[0018]在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F2‑
F1胞外域原聚体包含S190F和V207L取代、以及由N183GC和N428C取代引入的半胱氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组呼吸道合胞病毒(RSV)F胞外域三聚体，其包含：三个重组F2‑
F1胞外域原聚体，各自包含RSV F位置104
‑
144的缺失和RSV F位置103和145之间的甘氨酸
‑
丝氨酸肽接头，其中所述重组F2‑
F1胞外域原聚体包含以下氨基酸取代以使所述重组RSV F胞外域三聚体稳定化在融合前构象：由155C和290C取代引入的半胱氨酸之间的非天然二硫键；由183GC和428C取代引入的半胱氨酸之间的非天然原聚体间二硫键；190F和207L取代；和SEQ ID NO:2、6、11、30
‑
35、38
‑
39、42
‑
43、46
‑
47、50
‑
51或54
‑
55的残基26
‑
475或者SEQ ID NO:16或21的残基31
‑
480所示的氨基酸序列。2.权利要求1的重组RSV F胞外域三聚体，其包含(A)，其中所述155C和290C取代是S155C和S290C取代，所述190F和207L取代是S190F和V207L取代；和所述183GC和428C取代是N183GC和N428C取代。3.权利要求1的重组RSV F胞外域三聚体，其中所述重组F2‑
F1胞外域原聚体各自还包含L373R取代。4.权利要求1的重组RSV F胞外域三聚体，其中所述重组RSV F胞外域三聚体特异性结合于D25抗体。5.权利要求1的重组RSV F胞外域三聚体，其包含(A)，其中所述重组F2‑
F1胞外域原聚体包含RSV F位置26
‑
103和RSV F位置145至位置510
‑
525之一。6.权利要求5的重组RSV F胞外域三聚体，其中所述重组F2‑
F1胞外域原聚体包含RSV F位置26
‑
103和145
‑
513，或RSV F位置26
‑
103和145
‑
523。7.权利要求1的重组RSV F胞外域三聚体，其中所述重组F2‑
F1胞外域原聚体各自与C端三聚化结构域连接。8.权利要求7的重组RSV F胞外域三聚体，其中所述C端三聚化结构域包含T4Fibritin三聚化结构域。9.权利要求8的重组RSV F胞外域三聚体，其中所述T4 Fibritin三聚化结构域由GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF(SEQ ID NO:66)所示的氨基酸序列组成。10.权利要求7至9中任一项的重组RSV F胞外域三聚体，其中所述三聚化结构域与所述RSV F胞外域三聚体中的所述重组F2‑
F1胞外域原聚体的RSV F位置511或位置523连接。11.权利要求7至9中任一项的重组R...

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：美国政府由卫生和人类服务部的部长所代表，
类型：发明
国别省市：